基因工程的基本操作程序（第二課時）課件高二下學期生物人教版選擇性必修3

DNA片段的擴增及電泳鑒定基因工程AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragmentsDNA片段的擴增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments實驗原理（1）PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA

雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控

溫度的儀器。1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理：（2）PCR擴增DNA片段還利用了DNA半保留復制的原理。

一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。1.了解PCR和電泳鑒定的基本原理2.嘗試進行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物DNA片段的擴增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments2.DNA片段電泳鑒定的原理：（1）DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。（2）PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象（遷移速率與之呈負相關(guān)）等有關(guān)。（3）凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。DNA片段的擴增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragmentsDNA片段的擴增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments2.DNA片段電泳鑒定的原理：

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。

電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段。DNA片段的擴增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments

在電泳開始時使用低壓有利于條帶清晰，是因為點樣之后樣品內(nèi)分子是胡亂排列的，加上電壓之后才統(tǒng)一方向排列好。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。DNA片段的擴增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments

常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。

注意電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象

。DNA片段的擴增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments

電泳緩沖液類似色素提取的層析液，點樣孔通常位于電極的負極端，由于DNA分子在緩沖液中帶負電荷，在電場中DNA便向正極端移動，從而分離出大小不同的DNA片段。

DNA電泳一定要使用DNA

Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。

凝膠中的DNA分子通過染色，在波長為300nm的紫外燈下才能被檢測出來。DNA片段的擴增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments材料用具1.試劑：（1）無菌水、瓊脂糖；（2）電泳緩沖液（TAE或TBE）；（3）凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑——溴酚藍）；（4）核酸染料（常用核酸染料為EB即溴化乙錠）。DNA片段的擴增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments材料用具2.用具：（1）PCR儀（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴增）（2）微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）（3）微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）（4）一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）（5）電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）電泳裝置DNA片段的擴增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments推動桿調(diào)節(jié)旋鈕卸槍頭按鈕體積刻度吸液桿槍頭微量離心管PCR儀注意：加不同樣品時，需要更換槍頭DNA片段的擴增及電泳鑒定——DNA片段的擴增AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments——AmplificationofDNAfragments

用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。1.PCR加樣材料用量10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL方法步驟DNA片段的擴增及電泳鑒定——DNA片段的擴增AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments——AmplificationofDNAfragments

待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部。2.離心3.擴增

將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。DNA片段的擴增及電泳鑒定——DNA片段的擴增AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments——AmplificationofDNAfragments循環(huán)程序變性復性延伸預變性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min3.擴增參照下表的參數(shù)，設置好PCR儀的循環(huán)程序?？筛鶕?jù)目的片段長度適當調(diào)整延伸時間預變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。DNA片段的擴增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragmentsDNA片段的擴增加樣用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分離心待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）擴增參照下表的參數(shù)，設置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。DNA片段的擴增及電泳鑒定——DNA片段的電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments——ElectrophoresisidentificationofDNAfragments

根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。4.配制瓊脂糖溶液方法步驟DNA片段的擴增及電泳鑒定——DNA片段的電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments——ElectrophoresisidentificationofDNAfragments②凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。5.制備凝膠③將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜?！訕涌讉?cè)連電極負極。①將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，

以形成加樣孔。電泳緩沖液用來維持PH值，使DNA帶負電荷。DNA片段的擴增及電泳鑒定——DNA片段的電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments——ElectrophoresisidentificationofDNAfragments

將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物（Marker）。6.電泳加樣凝膠載樣緩沖液類似層析液7.電泳、觀察

接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。DNA片段的擴增及電泳鑒定AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragmentsDNA片段的電泳鑒定配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻制備凝膠將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜加樣將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物電泳接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相DNA片段的擴增及電泳鑒定——注意事項AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments——Mattersneedingattention1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。DNA片段的擴增及電泳鑒定——結(jié)果分析與評價AmplificationandelectrophoresisidentificationofDNAfragments——Resultsanalysisandevaluation1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結(jié)果。進行電泳鑒定的結(jié)果應該是一條條帶，該片段大小約為750bp。DNA片段的擴增及電泳鑒定——結(jié)果分析