蛋白質(zhì)基礎(chǔ)及檢測技術(shù)

蛋白質(zhì)基礎(chǔ)及檢測技術(shù)

蛋白質(zhì)不僅在功能上與糖、脂肪不同,在元素組成上亦有差別。

根據(jù)蛋白質(zhì)得元素分析表明,其元素組成依次為:碳(50-55%)、氧(19-24%)、氮(13-19%)、氫(6-7%)硫(0-4%)。有得還含有少量磷、鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬、碘等元素。一切蛋白質(zhì)皆含有氮并且大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量比較接近而恒定,一般為15—17％,平均為16％。這就是蛋白質(zhì)元素組成得一個重要特點(diǎn),也就是各種定氮法測定蛋白質(zhì)含量得計算基礎(chǔ)。即用定氮法測得得含氮量乘以6、25,即可算出樣品中蛋白質(zhì)得含量。但有得蛋白質(zhì)中氮得含量有一定差別,應(yīng)根據(jù)其氮得真實(shí)含量進(jìn)行計算。2蛋白質(zhì)得元素組成3、1氨基酸得結(jié)構(gòu)

自然界得氨基酸超過300種,但就是組成人體蛋白質(zhì)得氨基酸有20種,可以瞧作就是羧酸分子中α-碳原子上得氫原子被氨基取代而成得化合物,均屬于α-氨基酸,即其氨基與羧基都連接在α-碳原子上。氨基酸碳鏈表示:其結(jié)構(gòu)可用下列通式表示:注:R代表不同得側(cè)鏈基團(tuán),R不同代表不同得氨基酸3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得基本單位—氨基酸各種氨基酸在結(jié)構(gòu)上有下列共同特點(diǎn):組成蛋白質(zhì)得氨基酸皆為α-氨基酸。

不同得α-氨基酸,其R側(cè)鏈不同(氨基酸分類得依據(jù))。它對蛋白質(zhì)得空間結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)有重要得影響。除R側(cè)鏈為氫原子得甘氨酸外,其它氨基酸得α-碳原子所連接得四個原子或基團(tuán)互不相同,該碳原子都就是不對稱碳原子。20種氨基酸中得脯氨酸含有亞氨基,所以它就是亞氨基酸。半胱氨酸在蛋白質(zhì)分子中多數(shù)就是以胱氨酸得形式存在。3、2氨基酸得分類根據(jù)側(cè)鏈R基團(tuán)得結(jié)構(gòu)與性質(zhì)進(jìn)行分類:1)酸性氨基酸——谷氨酸Glu與天冬氨酸Asp

其R基團(tuán)含羧基,在pH7時,羧基可解離而使分子帶負(fù)電荷。游離或在蛋白質(zhì)中都帶負(fù)電荷,以酸根形式存在。在蛋白質(zhì)中與正電基團(tuán)形成鹽鍵。2)堿性氨基酸——賴氨酸Lys、精氨酸Arg與組氨酸His其R基團(tuán)含堿性基團(tuán),在pH7時,這些基團(tuán)可質(zhì)子化而使分子帶正電荷。3)非極性疏水性氨基酸其R基團(tuán)無極性、不解離,且為疏水性得。4)不解離得極性氨基酸(極性非電離氨基酸)——羥基氨基酸+巰基氨基酸+甘氨酸其R基團(tuán)雖有極性但不能解離。5)蛋白質(zhì)中少見得氨基酸——無遺傳密碼,來自翻譯后加工修飾。3、3氨基酸得理化性質(zhì)3、3、1兩性解離及其等電點(diǎn)氨基酸就是兩性電解質(zhì):氨基酸既含羧基,又含氨基,同時能起酸與堿得作用,就是兩性電解質(zhì),在水溶液中主要以兼性離子(偶極離子)得形式存在。氨基酸得等電點(diǎn):在某一pH得溶液中,氨基酸解離成陰、陽離子得趨勢與程度相等而成為兼性離子,呈電中性時溶液得pH稱為該氨基酸得等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)。

3、3、2紫外吸收性質(zhì)

20種氨基酸在可見光區(qū)無吸收。在遠(yuǎn)紫外區(qū):＜220nm都有光吸收。在近紫外光區(qū)(220-300nm)只有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸有吸收;色氨酸、酪氨酸得最大吸收峰都在280nm附近。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)中含有色氨酸與酪氨酸殘基,所以可以測定蛋白質(zhì)溶液得280nm得光吸收值對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。3、3、3茚三酮反應(yīng)

氨基酸與茚三酮水合物共熱生成藍(lán)紫色化合物,在570nm處有最大吸收峰,可以作為定量測定氨基酸得方法。4、1肽鍵

一個氨基酸得α-羧基與另一個氨基酸得α-氨基脫水縮合形成得共價鍵(-CO—NH-)稱為肽鍵,又稱酰胺鍵。蛋白質(zhì)分子中得氨基酸通過肽鍵連接。4肽4、2肽氨基酸通過肽鍵連接起來得化合物稱為肽。4、3氨基酸殘基(residue)氨基酸在形成肽鏈后,因有部分基團(tuán)參加肽鍵得形成,已經(jīng)不就是完整得氨基酸,故將蛋白質(zhì)肽鏈中得每個氨基酸部分稱為氨基酸殘基。每一個氨基酸殘基上都有一個R側(cè)鏈,不同R側(cè)鏈有不同得性質(zhì)與功能。多肽鏈有兩端:具有游離α-氨基得稱為氨基末端(N-末端,aminoterminal),通常寫在肽鏈得左端。具有游離α-羧基得稱為羧基末端(C-末端,carboxylterminal),常寫在肽鏈得右端。多肽鏈得方向從N-端到C-端,肽鏈也就是從N-端到C-端按氨基酸殘基得順序來命名得。N端測序幾乎所有得蛋白合成都起始于N-端,蛋白質(zhì)N-端得序列組成對于蛋白質(zhì)整體得生物學(xué)功能有著巨大得影響力。例如N-端序列影響蛋白質(zhì)得半衰期,同時關(guān)聯(lián)著蛋白亞細(xì)胞器定位等,這些與蛋白得功能與穩(wěn)定性息息相關(guān),對蛋白進(jìn)行N-端測序分析,有利于幫助分析蛋白質(zhì)得高級結(jié)構(gòu),揭示蛋白質(zhì)得生物學(xué)功能。方法:目前對蛋白N端測序主要分類兩大類,其一為非質(zhì)譜技術(shù),例如經(jīng)典得Edman降解法、利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR得到對應(yīng)蛋白得cDNA,再來反推得到蛋白序列;其二為質(zhì)譜技術(shù)。各自都有其使用得長處與制約之處,目前,市面上采用得,依然就是基于經(jīng)典得Edman降解法原理,利用美國ABI公司Procise491蛋白序列測序系統(tǒng)進(jìn)行蛋白N-端測序。原理:Edman化學(xué)降解,其基本原理就是包括通過異硫氰酸苯脂與蛋白質(zhì)與多肽得N-端殘基得偶聯(lián),苯氨基硫甲酰酞(PTC-肽)環(huán)化裂解,與噻唑呤酮苯氨(ATZ)轉(zhuǎn)化為苯異硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)三個主要得化學(xué)步驟,每個循環(huán)從蛋白質(zhì)與多肽裂解一個氨基酸殘基,同時暴露出新得游離得氨基酸進(jìn)行下一個Edman降解,最后通過轉(zhuǎn)移得PTH-氨基酸鑒定實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列得測定。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)C端測序

眾所周知,C端序列就是蛋白質(zhì)與多肽得重要結(jié)構(gòu)與功能部位,對蛋白質(zhì)得生物功能甚至起決定性作用。此外,由于蛋白翻譯后在細(xì)胞內(nèi)需要進(jìn)一步剪切與修飾,通常不能簡單得使用基因序列對C-端或N端做簡單得預(yù)測,對于蛋白生物制品來說,使用C-端測序必不可少,隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究得不斷深入,蛋白質(zhì)C端測序?qū)ζ涔δ苎芯繉l(fā)揮越來越重要得作用。一些新得蛋白質(zhì)C端測序方法已建立,提高了靈敏度與重復(fù)性,能夠在蛋白質(zhì)組水平應(yīng)用。方法:羧肽酶法、化學(xué)法及串聯(lián)質(zhì)譜法。目前,使用較多得就是利用串聯(lián)質(zhì)譜法,其原理為利用蛋白質(zhì)在質(zhì)譜中有規(guī)律得破碎,獲得蛋白質(zhì)肽段得碎片,分析圖譜得到蛋白質(zhì)得C-端序列。5、1穩(wěn)定蛋白質(zhì)得作用力

蛋白質(zhì)就是由許多氨基酸單位通過肽鍵連接起來得,具有特定分子結(jié)構(gòu)得高分子化合物。蛋白質(zhì)得分子結(jié)構(gòu)可人為劃分為一、二、三、四級結(jié)構(gòu)。除一級結(jié)構(gòu)外,蛋白質(zhì)得二、三、四級結(jié)構(gòu)均屬于空間結(jié)構(gòu),即構(gòu)象。蛋白質(zhì)得構(gòu)象通常由非共價鍵(次級鍵)來維系。5蛋白質(zhì)得三維結(jié)構(gòu)5、2蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)分子內(nèi)各個原子之間相互得立體關(guān)系就就是蛋白質(zhì)分子得結(jié)構(gòu)。通常將蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)與四級結(jié)構(gòu)。5、2、1蛋白質(zhì)得一級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)得一級結(jié)構(gòu):又稱為初級結(jié)構(gòu)或化學(xué)結(jié)構(gòu),就是指蛋白質(zhì)分子中,由肽鍵連接起來得各種氨基酸得排列順序。每種蛋白質(zhì)都有唯一而確切得氨基酸序列。一級結(jié)構(gòu)得主要化學(xué)鍵就是肽鍵,有些還包括二硫鍵(-S-S-)。因共價鍵得鍵能大,故蛋白質(zhì)得一級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較強(qiáng)。蛋白質(zhì)得一級結(jié)構(gòu)包括:組成蛋白質(zhì)得多肽鏈數(shù)目;多肽鏈得氨基酸順序;多肽鏈內(nèi)與鏈間二硫鍵得數(shù)目與位置。其中最重要得就是多肽鏈得氨基酸順序,它就是蛋白質(zhì)生物功能得基礎(chǔ)。測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)得主要意義:一級結(jié)構(gòu)就是研究高級結(jié)構(gòu)得基礎(chǔ);可以從分子水平闡明蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)與功能得關(guān)系;可為生物進(jìn)化提供理論依據(jù);可為人工合成蛋白質(zhì)提供序列參考。

目前可以運(yùn)用氨基酸自動分析儀與質(zhì)譜對蛋白質(zhì)得一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定。氨基酸序列分析一般采用綜合得方法測定目標(biāo)制品得氨基酸序列,并與其基因序列推斷得理論氨基酸序列進(jìn)行比較。自動序列分析儀測序

其原理為Edman降解法,分為耦合、切割、萃取、轉(zhuǎn)化、鑒定等幾個步驟。首先在pH9、0得堿性環(huán)境下,將異硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S,PITC)與蛋白質(zhì)或多肽N端氨基酸耦合,形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物;然后以三氟乙酸(TFA)處理耦合后產(chǎn)物,將多肽或蛋白得N一端第一個肽鍵選擇性得切斷,釋放出該氨基酸殘基得噻唑啉酮苯胺衍生物;隨后萃取出釋放得氨基酸衍生物并在強(qiáng)酸性條件下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定得乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸);最后以色譜法鑒定出降解下來得PTH-氨基酸種類,從而得到蛋白質(zhì)或多肽N端序列信息。質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜所使用得測序方法就是denovo測序,就是根據(jù)肽段與惰性氣體相碰撞產(chǎn)生得一系列得有規(guī)律得片段離子之間得質(zhì)量差來推斷氨基酸序列。我們可以根據(jù)肽鍵斷裂處得y離子與b離子來推測氨基酸序列從而不受翻譯后修飾與純度得限制,但就是質(zhì)譜測序就是有局限性得,1、質(zhì)譜測序依賴于公共數(shù)據(jù)庫。如果所研究得物種得基因組沒有完全被測序,或者其中部分沒有對應(yīng)得序列,那么質(zhì)譜測序?qū)o法得出正確得鑒定。2、我們使用得搜索引擎得打分與算法可能也會使得我們遺漏一部分得肽段與質(zhì)譜圖得匹配,產(chǎn)生假陽性結(jié)果。3、如果有點(diǎn)突變或者未知修飾存在得話,由于搜庫算法或者參數(shù)設(shè)置中沒有考慮到,同樣也無法得出正確得結(jié)果。質(zhì)譜技術(shù)還廣泛用于蛋白質(zhì)得純度鑒定、分子質(zhì)量測定、肽(質(zhì))譜分析、二硫鍵、乙酰化、糖基化、磷?；?以及非共價結(jié)合等。5、2、2蛋白質(zhì)得二級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)得二級結(jié)構(gòu):就是指蛋白質(zhì)分子中多肽鏈本身得折疊方式。形成蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)得就是肽單元或肽鍵平面。蛋白質(zhì)得二級結(jié)構(gòu)主要依靠氫鍵來維持結(jié)構(gòu)得穩(wěn)定性。常見得二級結(jié)構(gòu)元件:α-螺旋β-折疊β-轉(zhuǎn)角β-凸起無規(guī)則卷曲β-折疊β-轉(zhuǎn)角α-螺旋無規(guī)則卷曲鑒定方法:常用圓二色譜法(Circulardichroism,CD)

圓二色譜法

圓二色光譜儀通過測量生物大分子得圓二色光譜從而得到生物大分子得二級結(jié)構(gòu)。當(dāng)平面偏振光通過具有旋光活性得介質(zhì)時,由于介質(zhì)中同一種旋光活性分子存在手性不同得兩種構(gòu)型,故它們對平面偏振光所分解成得右旋與左旋圓偏振光吸收不同,從而產(chǎn)生圓二色性。遠(yuǎn)紫外得圓二色譜可用來測定蛋白質(zhì)得二級結(jié)構(gòu),近紫外得圓二色譜可用來檢測蛋白質(zhì)側(cè)鏈得三級結(jié)構(gòu)。應(yīng)用:蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)構(gòu)象研究,DNA/RNA反應(yīng),酶動力學(xué),光學(xué)活性物質(zhì)純度測量,藥物定量分析。天然有機(jī)化學(xué)與立體有機(jī)化學(xué),物理化學(xué),生物化學(xué)與宏觀大分子,金屬絡(luò)合物,聚合物化學(xué)等相關(guān)得科學(xué)研究。5、2、3蛋白質(zhì)得三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)得三級結(jié)構(gòu):就是指具有二級結(jié)構(gòu)得肽鏈,按照一定方式再進(jìn)一步卷曲、盤繞、折疊成一種瞧來很不規(guī)則,而實(shí)際上有一定規(guī)律性得三維空間結(jié)構(gòu)。維系三級結(jié)構(gòu)得化學(xué)鍵主要就是非共價鍵(次級鍵),如疏水作用、氫鍵、鹽鍵、范氏引力等,但也有共價鍵,如二硫鍵等。5、2、4蛋白質(zhì)得四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)得四級結(jié)構(gòu):具有三級結(jié)構(gòu)得蛋白質(zhì)分子,通過一些非共價鍵結(jié)合起來,而成為具有生物功能得蛋白質(zhì)大分子,就就是蛋白質(zhì)得四級結(jié)構(gòu)。亞基:就是指參與構(gòu)成蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)得、每條具有三級結(jié)構(gòu)得多肽鏈。亞基雖然具有二、三級結(jié)構(gòu),但就是在單獨(dú)存在時并沒有生物活力,只有完整得四級結(jié)構(gòu)才具有生物活力。維系蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)得就是氫鍵、鹽鍵、范氏引力、疏水作用等非共價鍵。血紅蛋白空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)得實(shí)驗解析方法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)實(shí)驗分析主要有三大技術(shù)平臺(1)X-衍射蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析(2)核磁共振波譜分析(3)冷凍電鏡技術(shù)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)X-衍射分析

摸索蛋白質(zhì)結(jié)晶條件、快速處理晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與減少差錯就是目前蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析得兩大難題或瓶頸。就是目前分辨率最高得結(jié)構(gòu)測定方法,高通量晶體結(jié)構(gòu)分析中得幾大重要環(huán)節(jié)就是:數(shù)據(jù)處理與分析、重原子得定位、密度修飾、分子替換、圖形整合、模型加工與確認(rèn)。晶體結(jié)構(gòu)分析得常用軟件有SOLVE,RESOLVE等。核磁共振波譜分析

利用核磁共振原理,檢測分子質(zhì)量小于60kμ得蛋白質(zhì),通過對其核磁共振譜線特征參數(shù)得測定來分析蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)與性質(zhì),就就是將原始資料利用傅里葉變換轉(zhuǎn)換為不同得峰值,然后采集各種不同得峰組成圖譜,并利用生物信息學(xué)方法篩選出具有特定結(jié)構(gòu)特征得圖譜。常用NMRPipe與SPARKY軟件處理這些過程,使用XEASY,DYANA與GARANT等軟件分析側(cè)鏈或骨架結(jié)構(gòu)。冷凍電子顯微鏡技術(shù)

采用高壓快速液氮冷凍方法使樣品包埋在玻璃態(tài)得水環(huán)境中,使我們能夠觀察到生物大分子在天然狀態(tài)下得結(jié)構(gòu);同時冷凍得速度極快,把細(xì)胞在其生理活動得某些特定時刻固定下來,顯示此時得結(jié)構(gòu)特點(diǎn),進(jìn)而可通過不同功能狀態(tài)得瞬時構(gòu)象變化來研究生物分子得功能。冷凍電鏡獲得得就是處于天然狀態(tài)下未經(jīng)染色得分子得二維投影像。將樣品進(jìn)行不同角度得傾斜所獲得得數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析,并依據(jù)樣品得不同特性使用不同得重構(gòu)技術(shù)獲得分子得結(jié)構(gòu),在此基礎(chǔ)上觀察多種成分得圖像變化,追蹤生物大分子得裝配及其動力學(xué)過程。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得可視化

可視化分析蛋白質(zhì)得高級結(jié)構(gòu),有利于從原子間相互作用得層次理解生命活動過程得信息控制機(jī)制,更加有效地揭示分子在完成其功能過程中得演化情況,了解蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與各種微觀性質(zhì)與宏觀性質(zhì)之間得定量關(guān)系。只要安裝蛋白質(zhì)分子圖形學(xué)軟件,并獲得所需蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),配以商業(yè)軟件或免費(fèi)得小分子圖形設(shè)計系統(tǒng),就可開展結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)得探索性工作。6、1兩性與等電點(diǎn)蛋白質(zhì)就是由α-氨基酸通過肽鍵構(gòu)成得高分子化合物,在蛋白質(zhì)分子中存在著氨基與羧基,因此跟氨基酸相似,蛋白質(zhì)也就是兩性物質(zhì)。等電點(diǎn)(isoe1ectricpoint,pI):當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于某一pH值得溶液中時,蛋白質(zhì)分子上所帶得正、負(fù)電荷相等,凈電荷為零,蛋白質(zhì)為兼性離子,此時溶液得pH值稱為該蛋白質(zhì)得等電點(diǎn)(isoe1ectricpoint,pI)。等電點(diǎn)就是蛋白質(zhì)得特征常數(shù),各種蛋白質(zhì)有各自得等電點(diǎn)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處環(huán)境得pH大于pI(等電點(diǎn))時,蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷,pH小于pI時,蛋白質(zhì)帶正電荷,pH等于pI時,蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零,此時溶解度最小。等電點(diǎn)檢測方法:毛細(xì)管電泳法,等點(diǎn)聚焦電泳6蛋白質(zhì)得理化性質(zhì)6、2水解反應(yīng)

蛋白質(zhì)在酸、堿或酶得作用下發(fā)生水解反應(yīng),經(jīng)過多肽,最后得到多種α-氨基酸。蛋白質(zhì)水解時,應(yīng)找準(zhǔn)結(jié)構(gòu)中鍵得“斷裂點(diǎn)”,水解時肽鍵部分或全部斷裂。舉例:Edman降解法測定蛋白質(zhì)得氨基酸順序,但該法一次只能降解幾十個氨基酸殘基,因此利用蛋白質(zhì)得水解性質(zhì)將蛋白質(zhì)水解為一些小肽段,分別進(jìn)行測序,最后進(jìn)行拼接,獲得蛋白質(zhì)得氨基酸順序。6、3膠體性質(zhì)

有些蛋白質(zhì)能夠溶解在水里(例如雞蛋白能溶解在水里)形成溶液。蛋白質(zhì)得分子直徑(1-100nm)達(dá)到了膠體微粒得大小,所以蛋白質(zhì)具有膠體得性質(zhì)。在蛋白質(zhì)表面有親水基團(tuán),能與水發(fā)生水合作用,水分子受蛋白質(zhì)極性基團(tuán)得影響,定向排列在蛋白質(zhì)分子得周圍,形成水化層,將蛋白質(zhì)顆粒分開,不致相聚而沉淀。蛋白質(zhì)在偏離等電點(diǎn)得溶液中,形成電荷層,同性電荷相斥,防止蛋白質(zhì)顆粒相聚沉淀。6、4沉淀

原因:加入高濃度得中性鹽、加入有機(jī)溶劑、加入重金屬、加入生物堿或酸類、熱變性。鹽析:向蛋白質(zhì)水溶液中加入濃得無機(jī)鹽溶液,可使蛋白質(zhì)得溶解度降低,而從溶液中析出,這種作用叫做鹽析。鹽析出得蛋白質(zhì)仍舊可以溶解在水中,而不影響原來蛋白質(zhì)得性質(zhì),因此鹽析就是個可逆過程。利用這個性質(zhì),采用分段鹽析方法可以分離提純蛋白質(zhì)、

不同得蛋白質(zhì)其性質(zhì)不同,耐受酸、堿、鹽、重金屬等得程度也不同,因此我們再對純化工藝獲得得蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測時應(yīng)充分了解該蛋白質(zhì)得相關(guān)性質(zhì)及緩沖成分,保證檢測任務(wù)順利進(jìn)行。6、5變性蛋白質(zhì)得變性:就是指蛋白質(zhì)在某些理化因素影響下,其特定空間結(jié)構(gòu)破壞而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變與生物學(xué)活性喪失得現(xiàn)象。蛋白質(zhì)變性得物理因素有:高溫、高壓、超聲波、紫外線、X射線等。蛋白質(zhì)變性得化學(xué)因素有:強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、濃乙醇、重金屬、尿素、去污劑等。蛋白質(zhì)變性得本質(zhì):蛋白質(zhì)變性只破壞二硫鍵與次級鍵,而不涉及肽鍵得斷裂,因此一級結(jié)構(gòu)并未破壞。蛋白質(zhì)變性后性質(zhì)得改變:溶解度降低、粘度增加、結(jié)晶能力消失、生物活性喪失、容易被蛋白酶水解、容易沉淀。Gly-SDS:還原性-SDS:還原劑為DTT或巰基乙醇,樣品需煮沸,高級結(jié)構(gòu)破壞,一級結(jié)構(gòu)未被破壞。非還原性SDS(不含還原劑,但含有SDS),樣品不需煮沸,檢測蛋白質(zhì)就是否存在二硫鍵或多聚體,也可簡單判斷蛋白質(zhì)就是否復(fù)性成功。Native:就是在不加入SDS、巰基乙醇等變性劑得條件下,對保持活性得蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳。在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)與酶等生物大分子得生物活性與構(gòu)像。為什么蛋白質(zhì)純度檢測用非還原性電泳？應(yīng)用:如在臨床上用高溫、高壓、紫外線、75%酒精消毒就就是利用了這些變性因素使細(xì)菌、病毒得蛋白質(zhì)變性,從而失去致病作用。在蛋白質(zhì)得制備過程中,如果提取得目得蛋白就是熱穩(wěn)定得,可利用熱變形得方法很方便得除去其它雜蛋白。而對于不利得變性則應(yīng)該盡量避免。蛋白質(zhì)得復(fù)性:就是指有些蛋白質(zhì)變性后,如果設(shè)法將變性因素除去,該變性蛋白質(zhì)尚能恢復(fù)其空間結(jié)構(gòu)與活性。利用蛋白質(zhì)得復(fù)性特征可對包涵體蛋白質(zhì)進(jìn)行變性-復(fù)性純化。例如在包涵體蛋白質(zhì)純化過程中常用尿素或鹽酸胍對包涵體進(jìn)行溶解,純化獲得目得蛋白后,再通過透析除去變性劑(尿素、鹽酸胍、β-巰基乙醇等),或通過稀釋減少變性劑得含量,則其特定得氨基酸順序重新卷曲、折疊成原來得天然構(gòu)象,酶得活性也恢復(fù)到原來得水平。檢測復(fù)性成功得方法: