細菌感染的實驗室診斷

第三章

細菌感染的病原學診斷第一節(jié)標本的采集和處理原那么一、標本采集的一般原那么1.早期采集2.無菌采集無菌部位:嚴格無菌操作有正常菌群部位：明確目的菌；選擇適宜的選擇培養(yǎng)基3.采用不同方法采集需氧菌或兼性厭氧菌厭氧菌：穿刺法采集4.采集適量標本和適當標本采集有明顯病變的標本根據(jù)病程采集不同的臨床標本5.平安采集二、標本的處理1.及時送檢2.運送與保存1〕根據(jù)待檢菌特點對標本進行冷藏、保溫或保持厭氧狀態(tài)2〕注意平安防護第二節(jié)細菌形態(tài)學檢查顯微鏡種類1.普通光學顯微鏡〔lightmicroscope〕光源：可見光2.暗視野顯微鏡〔darkfieldmicroscope〕暗背景，菌體發(fā)光用于檢查不染色的活細菌和螺旋體的形態(tài)及運動觀察3.相差顯微鏡檢查不染色活細菌的形態(tài)及某些內部結構4.熒光顯微鏡光源：100W~200W的高壓汞燈5.電子顯微鏡光源：電子流透射電鏡：觀察細菌內部超微結構掃描電鏡：對細菌外表結構及附件觀察一、不染色標本的檢查常用方法壓滴法懸滴法毛吸管法用于檢查厭氧菌動力用途動力試驗——檢查細菌有無動力制動試驗——鑒定血清型三、染色標本的檢查〔一〕常用染料色基：決定染料的顏色助色基：決定染料的酸堿性1.堿性染料電離后色基帶正電荷細菌染色常用，如美藍、結晶紫、堿性復紅等2.酸性染料用于細胞漿染色，如伊紅、酸性復紅、剛果紅3.復合染料〔中性染料〕堿性染料與酸性染料的復合物，如瑞氏染料、姬姆薩染料等4.單純染料如蘇丹染料，溶于脂肪溶劑，不溶于水，化學親和力低〔二〕常用的細菌染色法單染色法只用一種染料，如呂氏美藍復染色法用兩種或兩種以上不同顏色的染料細菌染色的一般程序1.涂片2.枯燥：自然枯燥為好3.固定4.初染5.媒染媒染劑6.脫色脫色劑7.復染1.革蘭染色法〔Gramstain〕〔1〕原理1〕細胞壁學說：兩種細菌細胞壁通透性不同2〕等電點學說3〕化學學說：兩種細菌含有RNA鎂鹽不同〔2〕方法：制片→結晶紫初染→碘液媒染→酒精脫色→復紅復染→結果革蘭陽性菌﹙G＋﹚：紫色革蘭陰性菌﹙G－﹚：紅色

2.抗酸染色法細菌著色后不被鹽酸酒精脫色的染色方法染料：石炭酸復紅、鹽酸酒精、美藍方法初染：5%石炭酸復紅加熱染色5min脫色：3%鹽酸酒精復染：呂氏美藍肺炎鏈球菌莢膜染色墨汁負染法芽胞染色第三節(jié)細菌別離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇培養(yǎng)基〔culturemedium〕由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品?！惨弧撑囵B(yǎng)基的組成成分1.營養(yǎng)物質碳源、氮源、無機鹽、水、生長因子〔1〕蛋白胨提供氮源植物胨:大豆動物胨：牛肉、動物組織等〔2〕肉浸液碳源、氮源〔3〕牛肉膏氮源〔4〕糖〔醇〕類碳源和能源〔5〕血液提供特殊生長因子、觀察溶血〔6〕無機鹽類常用元素：P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe等微量元素：Co、Zn、Mn、Cu、Mu等〔7〕雞蛋與動物血清用于某些特殊培養(yǎng)基〔8〕生長因子維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等2.凝固物質即賦形劑〔1〕瓊脂〔2〕明膠動物膠原組織熬制而成3.抑制劑和指示劑〔1〕抑制劑：膽鹽、煌綠、染料、抗生素等選擇培養(yǎng)基：參加一定種類的抑制劑，以抑制雜菌生長或減少生長，有利于檢出菌生長的培養(yǎng)基。〔2〕指示劑：酚紅、中性紅、中國藍等鑒別培養(yǎng)基：參加特定底物和指示劑〔二〕培養(yǎng)基的種類1.按培養(yǎng)基的物理性狀〔1〕液體培養(yǎng)基：增菌〔2〕固體培養(yǎng)基：純化，增菌〔3〕半固體培養(yǎng)基：動力檢測，保種

液體培養(yǎng)基固體斜面培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基2.按營養(yǎng)成分和用途分類〔1〕根底培養(yǎng)基：只有根本營養(yǎng)成分〔2〕營養(yǎng)培養(yǎng)基：加有血液、血清等〔3〕鑒別培養(yǎng)基：含有特定底物和指示劑〔4〕選擇培養(yǎng)基：含有抑制劑〔5〕特殊培養(yǎng)基：厭氧、細菌L型〔三〕培養(yǎng)基的選擇1.血平板最常用2.巧克力血平板奈瑟菌屬、流感嗜血桿菌3.腸道選擇培養(yǎng)基別離腸道細菌常用中國藍、EMB、MAC、SS4.堿性瓊脂或TCBS別離霍亂弧菌5.血液增菌培養(yǎng)基血液、骨髓增菌用6.營養(yǎng)肉湯增菌用〔四〕培養(yǎng)基的制備1.常用各種器具滅菌前的準備〔1〕培養(yǎng)皿：用紙包裹〔2〕試管：加塞后用紙包好〔3〕吸管和毛細管〔4〕燒瓶2.培養(yǎng)基制備的一般程序〔1〕調配根據(jù)培養(yǎng)基組成，準確稱取各組分，先加需要蒸餾水的一局部，再加培養(yǎng)基干粉，最后補足水量?！?〕溶化液體培養(yǎng)基不需加熱〔3〕調整pH值一般7.2~7.6〔4〕過濾澄清〔一般可以省略〕液體培養(yǎng)基：濾紙固體培養(yǎng)基：紗布〔5〕分裝平板：滅菌后冷卻至50℃~60℃時傾倒90mm25~30ml〔4mm〕：藥敏用90mm13~15ml(3mm)：培養(yǎng)用瓊脂斜面：分裝量為試管的1/4~1/3，滅菌后趁熱制成斜面，斜面長度2/3高層、半固體、液體：分裝量為試管長度1/4~2/3〔6〕滅菌高壓蒸汽滅菌無糖：103.4kPa121.3℃15~30min含糖：68.4kPa115℃15min流動蒸汽滅菌法血清、牛乳、雞蛋間歇蒸汽滅菌法〔7〕鑒定無菌試驗：將制好的培養(yǎng)基在35℃孵育過夜，判定是否滅菌合格。效果檢查：按不同的培養(yǎng)要求，接種相應菌種，觀察細菌的生長狀況，判斷培養(yǎng)基是否符合要求。〔8〕保存4℃冰箱保存，一周左右本卷須知1.器皿中性硬質玻璃器皿2.化學藥品化學純以上3.準確稱量，正確溶解4.準確測定培養(yǎng)基酸堿度5.保持澄清6.滅菌時間不宜過長，不宜反復滅菌二、別離培養(yǎng)3.移種或接種的根本步驟4.常用的接種方法〔1〕平板劃線法分區(qū)劃線法用于雜菌量較多的標本連續(xù)劃線法用于雜菌不多的標本〔2〕瓊脂斜面接種法—純培養(yǎng)〔3〕穿刺法—觀察細菌動力〔4〕液體培養(yǎng)基接種法—增菌〔5〕傾注平板法—計數(shù)細菌數(shù)量〔6〕涂布法—紙片法藥敏試驗〔二〕細菌的培養(yǎng)方法1.需氧培養(yǎng)法普通培養(yǎng)2.二氧化碳培養(yǎng)〔1〕二氧化碳培養(yǎng)箱〔2〕燭缸法〔3〕化學法3.厭氧培養(yǎng)〔三〕細菌的生長現(xiàn)象1.固體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象菌落：單個細菌在培養(yǎng)基上分裂繁殖成一堆肉眼可見的細菌集團。CFU：菌落形成單位，活菌計數(shù)用細菌菌落的描述大小、形狀、突起或扁平、邊緣、顏色、外表、透明度〔1〕光滑型菌落〔S型菌落〕外表光滑、濕潤、邊緣整齊〔2〕粗糙型菌落〔R型菌落〕外表粗糙、枯燥、邊緣不齊〔3〕粘液型菌落〔M型菌落〕菌落粘稠、有光澤、似水珠樣卷發(fā)樣菌落粗糙型菌落〔L-J〕粘液型菌落2.液體培養(yǎng)基中的生長情況外表生長均勻混濁生長沉淀生長三、細菌生化反響鑒定〔一〕碳水化合物的代謝試驗1.糖〔醇、苷〕類發(fā)酵試驗原理各種細菌酶系不同，分解糖〔醇、苷〕的能力各異，產(chǎn)物也不同。培養(yǎng)基單糖、雙糖、三糖、多糖應用腸道桿菌科細菌的鑒定

SugarFermentation

2.葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗〔O/F〕原理氧化型專性需氧菌發(fā)酵型產(chǎn)堿型不分解葡萄糖培養(yǎng)基Hugh-Leifson二氏培養(yǎng)基結果氧化管發(fā)酵管氧化型變黃不變發(fā)酵型變黃變黃產(chǎn)堿型不變不變〔陰性〕應用

鑒別腸桿菌科細菌與非發(fā)酵菌3.β-半乳糖苷酶〔ONPG〕試驗原理ONPG無色，經(jīng)β-半乳糖苷酶水解后生成黃色的鄰硝基酚方法〔1〕在含ONPG的培養(yǎng)基中接種純種細菌〔2〕制成菌懸液，參加甲苯，再加ONPG試劑結果陽性：變黃〔20~30min〕應用緩慢發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定4.七葉苷水解試驗原理葡萄糖七葉苷七葉素+Fe2+黑色化合物培養(yǎng)基七葉苷、膽汁七葉苷培養(yǎng)基結果陽性：培養(yǎng)基變黑用途鑒別腸球菌、G-桿菌及厭氧菌5.甲基紅〔methylredMR〕試驗原理葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇甲基紅-葡萄糖→丙酮酸→各種酸甲基紅+培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨水結果陽性：紅色陰性：黃色應用鑒別腸桿菌科細菌6.VP〔Voges-Proskauer〕試驗原理葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→二乙酰＋肌酸＋α萘酚→紅色化合物培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨水結果陽性：紅色應用鑒別腸桿菌科細菌〔二〕蛋白質和氨基酸的代謝試驗1.明膠液化試驗原理：某些細菌可產(chǎn)生明膠酶，分解明膠，使其失去凝固能力。方法：將待檢物接種于明膠培養(yǎng)基22℃培養(yǎng)7天結果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性應用：腸桿菌科細菌鑒別

3.硫化氫試驗原理含硫氨基酸→H2S+硫酸亞鐵→FeS黑色醋酸鉛→PbS黑色培養(yǎng)基醋酸鉛培養(yǎng)基結果陽性：黑色沉淀用途腸桿菌科菌屬間的鑒定4.尿素分解試驗原理尿素NH3+CO2+H2O(NH4)2CO3培養(yǎng)基尿素肉湯或尿素瓊脂培養(yǎng)基結果陽性：紅色用途腸桿菌科中變形桿菌的鑒定5.苯丙氨酸脫氨酶試驗原理苯丙氨酸苯丙酮酸+10%氯化鐵綠色化合物培養(yǎng)基苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基

結果陽性：綠色用途腸桿菌科中變形桿菌的鑒定6.氨基酸脫羧酶試驗〔三〕碳源和氮源利用試驗1.枸櫞酸鹽利用試驗原理銨鹽碳酸鈉+氨培養(yǎng)基枸櫞酸鹽培養(yǎng)基結果陽性：藍色陰性：綠色2.丙二酸鹽利用試驗利用枸櫞酸鹽生長+不能利用-

IMViC試驗大腸埃希菌++--產(chǎn)氣桿菌--++〔四〕各種酶類試驗1.氧化酶試驗原理方法菌落法濾紙法試劑紙片法結果深紫色為陽性2.過氧化氫酶試驗3.硝酸鹽復原試驗4.脂酶試驗5.卵磷脂酶試驗6.DNA酶試驗7.凝固酶試驗8.CAMP試驗9.膽汁溶菌試驗〔五〕抑菌試驗1.O/129試驗用于弧菌科的屬間鑒別2.桿菌肽試驗用于A群鏈球菌與其他鏈球菌間的鑒別3.奧普托欣試驗用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別第四節(jié)細菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學檢測利用抗原、抗體特異性結合的原理，用已知抗原檢測未知抗體，或用抗體檢測未知抗原。反向間接血凝試驗1.直接法：熒光素標記抗體2.間接法：熒光素標記二抗〔抗抗體〕3.免疫熒光菌球法酶聯(lián)免疫吸附試驗-ELISA1.雙抗體夾心法2.競爭法陽性-無色〔二〕抗體檢測用的細菌或其特異性抗原檢測病人血清中有無相應抗體及其效價的動態(tài)變化，輔助診斷某些傳染病。二、分子生物學檢測三、細菌毒素的檢測〔一〕內毒素1.內毒素的致熱作用〔體內實驗〕原理：內毒素產(chǎn)生于G-菌，菌體死亡后釋放，作用于體溫調節(jié)中樞，引起發(fā)熱。方法：〔1〕將家兔分成兩組，每組4只，測量基礎體溫并記錄?！?〕用無菌注射器抽取待檢物注入一組家兔耳靜脈，另一組注射等量生理鹽水?！?〕觀察動物反響，并間隔30min測量兩組家兔體溫。結果：陽性試驗組體溫升高對照組體溫正常應用：無菌的生物制品2.鱟試驗〔體外實驗〕原理：鱟血液中含有一種變形細胞，此細胞裂解物可與微量內毒素起凝膠反響，即細胞裂解物中的一種酶被激活，使細胞裂解物中的蛋白質形成凝膠。鱟試劑：鱟變形細胞裂解物方法〔1〕翻開3支鱟試劑安瓶，各加0.1ml無菌蒸餾水使之溶解，同時編號。〔2〕向3支安瓶中分別加待測物、標準內毒素、無熱原生理鹽水各0.1ml?！?〕輕輕搖勻，垂直放37℃水浴，15~30min后觀察結果。鱟試驗結果-不形成凝膠+形成凝膠，但不牢固++形成牢固凝膠，倒持安瓶凝膠不動。應用鱟試驗〔二〕外毒素1.體內毒力試驗原理：細菌外毒素對機體具有強烈毒性作用，但可被相應抗毒素中和，中和后，實驗動物不產(chǎn)生中毒病癥。如：破傷風外毒素的毒性作用和抗毒素保護作用。2.體外毒力試驗抗原抗體反響四、動物實驗〔一〕實驗動物的分類1.遺傳學控制方法分類〔1〕近交系動物純系動物〔2〕突變種純系動物〔3〕雜種動物2.微生物學控制方法分類〔1〕無菌動物〔GF〕〔2〕悉生動物〔GB〕〔3〕無特殊病原體動物〔SPF〕〔4〕清潔動物或最低限度疾病動物〔5〕普通動物〔二〕實驗動物的選擇1.選擇敏感動物2.選擇不同種類和品系動物3.