DB1302T 374-2013 水產(chǎn)品中氯霉素檢測技術(shù)規(guī)范

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DB1302唐 山 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB1302/T374—2013水產(chǎn)品中氯霉素檢測技術(shù)規(guī)范2013-11-15發(fā)布 2013-12-15實(shí)施唐山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB1302/T374—2013DB1302/T374—2013前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由唐山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：鄭百芹、蒙君麗、張建民、葛懷禮、董李學(xué)、劉洋、周鑫、吳穎、肖琎、李玉文、張榮華、牛惠超。DB1302/T374—2013DB1302/T374—2013PAGEPAGE1水產(chǎn)品中氯霉素檢測技術(shù)規(guī)范范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)品中氯霉素的膠體金免疫層析測定方法、酶聯(lián)免疫吸附測定方法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)品中氯霉素殘留的快速集成檢測。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單或修訂版）適用于本文件。GB/T6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法SC/T3016 水產(chǎn)品抽樣方法農(nóng)業(yè)部781號公告-2-2006 動(dòng)物源食品中氯霉素殘留量的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜農(nóng)業(yè)部1025號公告-26-2008 動(dòng)物源性食品中氯霉素類殘留檢測 酶聯(lián)免疫吸附測定法抽樣方法按照SC/T3016執(zhí)行。膠體金免疫層析法適用范圍本方法適用于水產(chǎn)品中氯霉素的快速篩選檢測，最低檢測濃度1μg/kg。方法原理膠體金快速檢測試紙條采用競爭抑制免疫層析原理。若樣品中含有氯霉素，氯霉素與金標(biāo)抗體相結(jié)合，封閉金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止金標(biāo)抗體與纖維素膜上氯霉素偶聯(lián)物結(jié)合，顯色較弱或不顯色；若樣品中不含有氯霉素，則不能阻止金標(biāo)抗體與纖維素膜上的氯霉素偶聯(lián)物結(jié)合，顯色較強(qiáng)。試劑和材料以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純試劑，水為符合GB/T6682規(guī)定的三級水。4～30乙酸乙酯正己烷儀器和設(shè)備組織勻漿機(jī)4.4.2天平：感量（0.01g）振蕩器或混旋器微量移液器：單道20μL～200μL、100μL～1000μL計(jì)時(shí)器吹風(fēng)機(jī)樣品前處理稱取已均質(zhì)樣品1于l5mL1mL5min；移液槍吸取澄清液(約300μL～400μL)于50mL錐底離心管中，吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干；用0.3mL正己烷溶解殘?jiān)?，加?.3mL緩沖液，振蕩器振蕩1min，靜置3min，供測試用。檢測和結(jié)果判定檢測取出檢測條，平放，用移液槍或塑料吸管取待測液80μL(2～3滴)于加樣孔，10min～15min內(nèi)觀察結(jié)果，目測檢測線。結(jié)果判定結(jié)果判定如圖1所示。其中C線為質(zhì)控線，T線為檢測線。CTTCCTTC注：檢測條在打開包裝1h內(nèi)使用。待測條 陰性 陽性 無效圖1檢測結(jié)果判定酶聯(lián)免疫吸附法適用范圍本方法適用于水產(chǎn)品中氯霉素的快速篩選檢測，最低檢測濃度0.25μg/kg。方法原理采用ELISA試劑和材料以下所用的試劑，除特殊注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T6682規(guī)定的二級水。氯霉素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒乙酸乙酯正己烷復(fù)溶液（試劑盒自帶）儀器設(shè)備微孔板酶標(biāo)儀（450nm/630nm）均質(zhì)器振蕩器渦旋儀離心機(jī)（3000r/min）5.4.6天平（0.01g）20μL～200μL、100μL～1000μL氮?dú)獯蹈裳b置樣品前處理按照農(nóng)業(yè)部1025號公告-26-2008方法進(jìn)行樣品前處理。樣品檢測測定條件:將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20～25）平衡30min加樣：加入標(biāo)準(zhǔn)溶液/樣品50μL，然后每孔分別加入氯霉素酶標(biāo)記物溶液50μL。溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于室溫（20℃～25℃）反應(yīng)30min。洗滌：揭開封板膜，每孔加入稀釋后的洗滌液250μL，連續(xù)洗板3次，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。顯色：加入底物溶液A50μL和底物溶液B50μL，振蕩混勻，2520min。測定：加入終止液50μL，輕輕振蕩混勻，在5min450nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度值。結(jié)果判定計(jì)算B/0

百分吸光度值（%）= B ×100%B0式中：B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品溶液的吸光度值；B0B0繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中氯霉素濃度XY氯霉素含量(μg/kg)＝C×0.5式中：C（g/k；0.5：樣品稀釋倍數(shù)。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法適用范圍本方法適用于水產(chǎn)品中氯霉素的確證檢測，檢出限為0.1μg/kg，定量下限為0.2μg/kg。方法原理采用間位氯霉素作內(nèi)標(biāo)，試料依次用乙腈、40g/L試劑和材料除方法另有規(guī)定外，試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T6682中一級水的規(guī)定。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(CAP)甲酸：色譜純內(nèi)標(biāo)：間位氯霉素(m-CAP)或氘代氯霉素（CAP-D5）乙腈：色譜純氯化鈉正已烷乙酸乙酯氫氧化鈉溶液：5mol/L甲醇：色譜純40g/L氯化鈉溶液：稱取氯化鈉4.Og，用水溶解并稀釋至100mL，臨用前配制。水飽和乙酸乙酯溶液：取400mL乙酸乙酯于500mL棕色試劑瓶中，加水50mL，加蓋、振搖靜置，使用時(shí)取上層溶液。乙腈飽和的正己烷：取100mL乙腈和100mL正己烷混合，振搖靜置，使用時(shí)取上層溶液。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱定氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置于100mL容量瓶中，甲醇超聲溶解并稀釋成濃度為100μg/mL。-20℃保存，有效期1年。間位氯霉素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：精密稱定間位氯霉素10mg，置于100mL容量瓶中，甲醇超聲溶解并稀釋成濃度為100μg/mL。-20℃保存，有效期1年。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相稀釋成濃度為10ng/mL、50ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。4℃保存，有效期3個(gè)月。間位氯霉素內(nèi)標(biāo)工作液準(zhǔn)確量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相稀釋成濃度為20ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。4℃保存，有效期3個(gè)月。C18固相萃取柱(500mg/3cc)有機(jī)濾膜：0.22μm儀器和設(shè)備高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧電離源離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速大于等于6000r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀6.4.4天平：（感量為0.0001g）6.4.5分析天平：（感量0.00001g）微量移液槍：20μL～200μL、100μL～1000μL、1mL～5mL固相萃取裝置渦旋振蕩器粉碎機(jī)試樣制備試料的制備包括：——取絞碎后的供試樣品，作為供試試料。——取絞碎后的空白樣品，作為空白試料?！〗g碎后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。操作方法提取取10000r/min勻漿1min的供試試料5g0.02g)置50mL離心管中，加1μg/mL間位氯霉素內(nèi)標(biāo)工作液10μL，加乙腈5mL，40g/L氯化鈉溶液5mL，渦旋振蕩2min，6000r/min離心10min，取50mL離心管中，重復(fù)提取1次，合并提取液。提取液中加乙腈飽和的正己烷5mL，渦旋振蕩1min，6000r/min離心10min，棄去上層液，重復(fù)1次。加水飽和乙酸乙酯溶液5mL，渦旋振蕩lmin，6000r/min離心5min，將上層液轉(zhuǎn)移到100mL雞心瓶中，重復(fù)提取1次，合并提取液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸干，殘?jiān)盟?乙腈(40：60)3mL溶解，備用。凈化固相萃取柱依次用甲醇10mL，水10mL預(yù)洗，取備用液過柱。用水3mL洗柱，洗2次后，用流動(dòng)相4mL以1mL/min的速度將樣品洗脫入15mL離心管中。洗脫液中加水飽和乙酸乙酯溶液4mL，渦旋振蕩1min，2000r/min，離心5min，取上層液，重復(fù)提取1次，合并提取液，氮?dú)饬飨麓蹈?。用流?dòng)相1.0mL溶解殘余物后，渦旋震蕩1min，過0.22μm濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定?？瞻自囼?yàn)取空白試料，按6.6.1和6.6.2操作。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備0.5、1.0、2.0、5.0