基因工程的基本操作程序（第二課時(shí)）課件-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第三章

基因工程

第2節(jié)基因工程的基本操作程序

1、基因工程的基本操作程序（4個(gè)步驟）？2、如何獲取目的基因？

3、什么是PCR？PCR的條件、過(guò)程、結(jié)果分別是什么？復(fù)習(xí)回顧

獲取了足夠量的目的基因后，可以直接把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞嗎？就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無(wú)法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)直接被分解

不能原因那怎樣才能讓基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代呢？本節(jié)聚焦本節(jié)聚焦基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法有哪些？活動(dòng)一：請(qǐng)同學(xué)們自主閱讀教材P80，小組合作思考討論完成問(wèn)題。1.基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的？載體還需要哪些結(jié)構(gòu)？各個(gè)元件有什么作用？2.目的基因插入什么位置？目的基因插入位點(diǎn)是隨意的嗎？3.請(qǐng)文字和箭頭表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程。4.使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，是否只會(huì)得到一種重組DNA？如果不能，怎么改進(jìn)？二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。1目的：二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建2組成：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)位于基因的上游；RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。位于基因的下游；終止轉(zhuǎn)錄便于重組DNA分子的篩選和鑒定。能控制表達(dá)所需要的特殊性狀二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建①

用一定的限制酶切割載體，使其出現(xiàn)一個(gè)切口。②

用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③

將切下的Bt基因片段拼接到載體的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子。載體基因表達(dá)載體3構(gòu)建過(guò)程：二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建啟動(dòng)子下游和終止子上游。因?yàn)橹挥胁迦朐趩?dòng)子和終止子之間，目的基因才可以正常表達(dá)。1.構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)目的基因插入的位置應(yīng)該在哪里？為什么？活動(dòng)二：思考問(wèn)題,分析基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的和方法。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建2.請(qǐng)結(jié)合下圖思考，使用哪種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA可以正確構(gòu)建基因表達(dá)載體？BamHⅠ和HindⅢ二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建總結(jié)歸納1：限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。若載體上有兩個(gè)及以上的標(biāo)記基因，則可合理對(duì)其中一些標(biāo)記基因進(jìn)行酶切破壞，從而達(dá)到比1個(gè)標(biāo)記基因更高的篩選成功率，防止只有1個(gè)標(biāo)記基因時(shí)出現(xiàn)的“假陽(yáng)性”(即未成功導(dǎo)入目的基因的載體也能正常表達(dá)標(biāo)記基因，造成無(wú)效篩選)。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建(3)善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點(diǎn)時(shí)，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點(diǎn)的兩種不同的限制酶，對(duì)目的基因所在序列和載體進(jìn)行剪切，即“雙酶切法”。其優(yōu)點(diǎn)和作用是：①防止目的基因環(huán)化；②避免目的基因與載體反向連接，即DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動(dòng)子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動(dòng)方向”)必須是相同的。否則目的基因?qū)牒鬅o(wú)法正常轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來(lái)源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當(dāng)不適合選擇某種限制酶時(shí)，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建總結(jié)歸納2：區(qū)分啟動(dòng)子和終止子與起始密碼子和終止密碼子名稱啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子化學(xué)成分DNA片段DNA片段mRNA上三個(gè)相鄰堿基mRNA上三個(gè)相鄰堿基位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束翻譯的起始信號(hào)決定翻譯過(guò)程的結(jié)束二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建啟動(dòng)子的類型根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式，可分為：①組成型啟動(dòng)子

能夠調(diào)控基因的表達(dá)，使其基本恒定在一定程度上，從而使基因在不同部位或組織中的表達(dá)水平不存在明顯差異。這類啟動(dòng)子一般來(lái)自管家基因，可連續(xù)不斷地啟動(dòng)基因的表達(dá)。②組織特異性啟動(dòng)子

其調(diào)控作用使得基因往往只在某些特定器官或組織中表達(dá)，且表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。其最大的優(yōu)勢(shì)是其啟動(dòng)的外源基因在受體中僅在需要的部位特異表達(dá)，克服了組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)的外源基因在受體植物中非特異、持續(xù)、高效表達(dá)所造成的浪費(fèi)，增加了轉(zhuǎn)基因的效果。③誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。1(2023·新課標(biāo)，6)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli

DNA

連接酶連接B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用

T4DNA連接酶連接C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用

T4DNA連接酶連接D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接C課堂練習(xí)2.(2023·湖北，4改編)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是A.若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，

不一定含有目的基因C.若用ScaⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Tet(四環(huán)素)的培養(yǎng)基中能形成菌落D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中

能形成菌落D課堂練習(xí)將目的基因與載體結(jié)合，構(gòu)建好基因表達(dá)載體后，下面該進(jìn)行什么操作？基因工程第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞新課推進(jìn)活動(dòng)三：請(qǐng)同學(xué)們自主閱讀教材P81—82倒數(shù)第二段文字，思考以下問(wèn)題。1.總結(jié)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有哪些？各自適用于什么生物？2.農(nóng)桿菌的特點(diǎn)？農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理。3.請(qǐng)文字和箭頭表示農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過(guò)程。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)化。實(shí)質(zhì)：將目的基因整合到受體細(xì)胞基因組中。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法顯微注射法Ca2+轉(zhuǎn)化法（我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）（常用）轉(zhuǎn)化的概念：三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞Ca2+處理細(xì)胞重組基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收重組DNA分子42℃,1min冰上3minCa2＋處理

常用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌應(yīng)用最為廣泛，一般先用Ca2＋處理大腸桿菌細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。1操作方法：2過(guò)程：1、導(dǎo)入微生物細(xì)胞：三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞顯微注射法示意圖普通鼠與生長(zhǎng)速度加快的轉(zhuǎn)基因鼠目的基因的表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵發(fā)育獲得具有新性狀的動(dòng)物①個(gè)體大，易操作。②受精卵全能性高，易培養(yǎng)成完整個(gè)體。顯微注射法1操作方法：2過(guò)程：2、導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞：三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）花粉管通道法（我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）方法2：在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。方法1：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因適用生物：開花植物3、導(dǎo)入植物細(xì)胞：三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。實(shí)質(zhì)是基因重組。①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力。Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到被侵染的受體細(xì)胞，并將其整合到該細(xì)胞染色體的DNA上。②原理：3、導(dǎo)入植物細(xì)胞：三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

在用土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的過(guò)程中，一定要將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA上的原因是什么？大型環(huán)狀DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因Ti質(zhì)粒表達(dá)載體農(nóng)桿菌植物細(xì)胞植物細(xì)胞染色體DNA新性狀植株構(gòu)建轉(zhuǎn)入導(dǎo)入插入表達(dá)（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法③過(guò)程：3、導(dǎo)入植物細(xì)胞：三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第一次拼接

是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接

指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體DNA上。第一次導(dǎo)入是將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入

是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。第一次拼接第二次拼接第一次導(dǎo)入第二次導(dǎo)入兩次拼接和兩次導(dǎo)入：三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)Ca+處理法體細(xì)胞或受精卵受精卵原核細(xì)胞將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的DNA上→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca+處理細(xì)胞→微生物細(xì)胞膜的通透性增加形成感受態(tài)細(xì)胞→重組質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子將目的基因?qū)氩煌?xì)胞的方法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞A.圖中Ⅰ是質(zhì)粒，步驟①需要用到限制酶和DNA連接酶B.圖中Ⅱ是含目的基因的重組質(zhì)粒，步驟②是將重組質(zhì)粒導(dǎo)入棉花細(xì)胞C.圖中Ⅲ是農(nóng)桿菌，通過(guò)步驟③將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞D.剔除培育成功的抗蟲棉體內(nèi)的四環(huán)素抗性基因不會(huì)影響抗蟲基因的表達(dá)3.如圖為科學(xué)家通過(guò)基因工程培育抗蟲棉時(shí)，從蘇云金桿菌中提取抗蟲基因“放入”棉花細(xì)胞中，與棉花的DNA分子“結(jié)合起來(lái)”而發(fā)揮作用的過(guò)程示意圖。以下相關(guān)說(shuō)法不正確的是B課堂練習(xí)4.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的方法正確的是（）①將毒素蛋白注射到棉受精卵中；②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；③將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入農(nóng)桿菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)④將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，借助花粉管通道進(jìn)入受精卵。A.①②B.③④