生物樣本中抗生素耐藥菌的快速檢測(cè)方法-拉曼光譜法征求意見(jiàn)稿

1T/FDSAXXXX—202X生物樣本中抗生素耐藥菌的快速檢測(cè)方法拉曼光譜法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了生物樣本中抗生素耐藥菌的快速檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于臨床分離株、尿液等樣本中抗生素耐藥菌的快速測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成對(duì)本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理樣品經(jīng)過(guò)濾除去大分子、細(xì)菌培養(yǎng)、抗生素作用等方法，加表面增強(qiáng)試劑對(duì)待測(cè)液中的目標(biāo)分子拉曼信號(hào)進(jìn)行增強(qiáng)。用拉曼光譜儀采集樣品的拉曼光譜信號(hào)進(jìn)行分析，以重水標(biāo)記特有的拉曼特征峰（2180cm-1）作為定性基準(zhǔn)峰，建立方法數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)待測(cè)樣本中目標(biāo)物的快速檢測(cè)。5試劑和材料5.1試劑除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1.1二甲基亞砜。5.1.2甲醇。5.1.30.1mol/L鹽酸。5.1.4磷酸鹽緩沖液。5.1.5重水（D2O）。5.1.6慶大霉素。5.1.7營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：稱(chēng)取8g營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，溶解于200mL蒸餾水中，121℃高壓5.1.8MH培養(yǎng)基：稱(chēng)取4.2gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶解于200mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌2T/FDSAXXXX—202X5.2材料5.2.1塑料具塞離心管：2mL和10mL。5.2.2移液吸頭：200μL，1000μL和5000μL。6儀器設(shè)備6.1流式拉曼光譜儀6.2穩(wěn)頻激光光源：發(fā)射波長(zhǎng)為532±1nm，線寬＜0.1nm，能量≥250mW；光譜分辨率≤10cm-1；光譜響應(yīng)范圍300cm-1~2700cm-1，或大于該響應(yīng)范圍。6.3移液器：0.1-2.5μL、2-20μL、10-100μL和100-1000μL。6.4渦旋振蕩器。6.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥10000轉(zhuǎn)/min。6.6電子天平：感量為0.01g和0.0001g。6.7塑料具塞離心管：2mL和50mL6.8移液吸頭：10μL，200μL和1000μL。6.9麥?zhǔn)蠞岫葍x。6.10孵育箱。7分析步驟7.1取樣制樣臨床分離株：將平板上的單菌落挑取至含有MH培養(yǎng)基的玻璃管中，混勻；麥?zhǔn)蠞岫葍x檢測(cè)為0.5，對(duì)照濁度表將菌懸液稀釋至5×105CFU/mL；尿液樣品：取樣品用5μm過(guò)濾器對(duì)尿液樣本進(jìn)行過(guò)濾取出大分子雜質(zhì)，麥?zhǔn)蠞岫葍x檢測(cè)菌懸液濁度，對(duì)照濁度表將菌懸液稀釋至5×105CFU/mL；7.2抗生素作用將倍比稀釋的各濃度梯度的抗生素分別與菌懸液混合。如慶大霉素，用一級(jí)水配制母液濃度為50mg/mL備用，將母液稀釋至960μg/mL后，采用倍比稀釋法在安全柜中完成各濃度梯度的抗生素配制，后續(xù)分別取20μL不同濃度慶大霉素加入到580μL菌懸液中，獲得含有0.5-32μg/mL的菌懸液，混勻，37oC孵育1小時(shí)。7.3重水標(biāo)記將重水使用0.22μm無(wú)機(jī)或有機(jī)濾膜配合注射器過(guò)濾滅菌，取一定量重水加入到孵育1小時(shí)的菌懸液中，混勻，重水終濃度為40%，37oC孵育2小時(shí)。7.4離心清洗孵育完成后，混合體系完全取出，將液體移至離心管中6500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，水洗3T/FDSAXXXX—202X三次，等體積水重懸。7.5測(cè)定7.5.1拉曼光譜儀器分析參考條件50×倍鏡下激光能量≥9.47mW，數(shù)據(jù)采集時(shí)間≥6s。7.5.2測(cè)定取3μL離心重懸后樣本滴加在鋁片上，干燥后進(jìn)行拉曼檢測(cè)。7.6質(zhì)控試驗(yàn)每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。7.6.1陰性對(duì)照稱(chēng)取空白試樣，按照7.1-7.5步驟與樣品同法操作。7.6.2陽(yáng)性對(duì)照制備菌懸液，將加入抗生素?fù)Q成等體積水，按照7.1-7.5步驟與樣品同法操作。8結(jié)果計(jì)算和表達(dá)8.1定性儀器軟件將測(cè)試結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)中的對(duì)應(yīng)樣本譜圖進(jìn)行匹配計(jì)算，根據(jù)測(cè)試譜圖與軟件內(nèi)置譜圖進(jìn)行特征峰比對(duì)計(jì)算，進(jìn)而判定待測(cè)樣本中是否含有目標(biāo)物特征峰，如待測(cè)樣本待測(cè)樣本含有目標(biāo)物特征峰，并且特征峰與空白樣本存在顯著性差異，儀器將顯示陽(yáng)性或檢出，如待測(cè)樣本不含有目標(biāo)物特征峰或與空白樣本無(wú)顯著性差異，儀器將顯示陰性或未檢出。重水的表面增強(qiáng)拉曼光譜圖參附錄A.1。8.2確證本方法為初篩方法，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)用其他技術(shù)手段進(jìn)行確證。9方法性能指標(biāo)9.1檢出限本方法檢出限為40%重水當(dāng)量。9.2靈敏度靈敏度應(yīng)≥95%。9.3特異性特異性應(yīng)≥95%。9.4假陰性率假陰性率應(yīng)≤5%。4T/FDSAXXXX—202X9.5假陽(yáng)性率假陽(yáng)性率應(yīng)≤5%。性能指標(biāo)計(jì)算方法見(jiàn)附錄B中表B.1。5T/FDSAXXXX—202X含重水質(zhì)控樣本的拉曼光譜圖圖A.1含重水質(zhì)控樣本的拉曼光譜圖法6T/FDSAXXXX—202X快速檢測(cè)方法性能計(jì)算表快速檢測(cè)方法性能指標(biāo)計(jì)算表見(jiàn)表B.1。表B.1性能指標(biāo)計(jì)算方法樣品情況a檢測(cè)結(jié)果b總數(shù)N11N12N1.=N11+N12N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異(х2)x2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽(yáng)性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對(duì)準(zhǔn)確度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有