諾如病毒研究進(jìn)展及一起郵輪諾如病毒感染疫情的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

上海國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心實(shí)驗(yàn)室

章琪方筠王家棟

Telmail:第一局部：食源性急性胃腸炎綜述食源性急性胃腸炎流行現(xiàn)狀Source:FoodborneOutbreakReportingSystem:///主要病原體：毒素介導(dǎo)〔Toxin-mediated):水樣便病毒：諾如，輪狀，星狀，腺病毒細(xì)菌：蠟樣芽孢桿菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌，金黃色葡萄球菌，產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌侵襲性病原體〔Invasivemicrobes):膿血便細(xì)菌：大腸桿菌〔侵襲性、致病性、出血性〕，沙門(mén)氏菌，空腸彎曲桿菌，志賀氏菌，艱難梭菌原蟲(chóng)：賈第鞭毛蟲(chóng)，溶組織內(nèi)阿米巴滲透性病原體〔Penetratingmicrobes):系統(tǒng)感染細(xì)菌：傷寒、副傷寒沙門(mén)氏菌，鼠疫桿菌感染途徑：病人接觸：諾如病毒、志賀氏菌、出血性大腸桿菌旅行：大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、賈第鞭毛蟲(chóng)郵輪：諾如病毒〔Cruise-shipvirus〕動(dòng)物接觸：沙門(mén)氏菌，出血性大腸桿菌，賈第鞭毛蟲(chóng)疫水：隱孢子蟲(chóng)，出血性大腸桿菌污染的食物：沙門(mén)氏菌致病性：感染劑量：〔病原體顆粒數(shù)〕隱孢子蟲(chóng)：10-100志賀氏菌：10-100出血性大腸桿菌：10-100空腸彎曲桿菌：104–106沙門(mén)氏菌：105–108霍亂弧菌：105–108產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌：108鼠疫桿菌：109SlutskerL,etal.AnnInternMed1997;126:505-13食源性急性胃腸炎的防控仍然是很大的挑戰(zhàn)！諾如病毒：10-100第二局部：諾如病毒介紹歷史：In1929,Zahorskyproposedthename“wintervomitingdisease〞todescribesoutbreaksofpresumedviralgastroenteritisInthe1940s,GordondemonstratedthatpooledstoolfiltratesobtainedfrompatientsinaninstitutionaloutbreakofnonbacterialgastroenteritiscouldinfectinoculatedvolunteersIn1968,CDCinvestigatedanoutbreakofvomitingdiseaseinanelementaryschoolinNorwalkOH:50%ofstudentsandteachersdevelopedgastroenteritisKaplanusedimmuneelectronmicroscopytoidentifyviralparticlesinthestoolsofvolunteersinfectedwiththe“Norwalk〞strainVirusinitiallyclassifiedassmallroundviruses,laterreclassifiedascaliciviruseswhengenomeclonedDr.AlbertKapikian1972,electronmicroscopySmallRound-StructuredVirus(SRSV)27nmKapikianAZ,etal.Visualizationbyimmuneelectronmicroscopyofa27-nmparticleassociatedwithacuteinfectiousnonbacterialgastroenteritis.JVirol,1972,10(5):1075-1081.美國(guó)2006年諾如病毒引起的急性胃腸炎數(shù)量發(fā)生場(chǎng)所疫情數(shù)量郵輪37養(yǎng)老院37餐館13醫(yī)院7學(xué)校3聚會(huì)3其它26總計(jì)

126流行現(xiàn)狀：我國(guó)流行現(xiàn)狀1996年和1997年分別在北京和太原開(kāi)展的人群血清標(biāo)本中的諾瓦克樣病毒特異性IgG抗體檢測(cè)說(shuō)明，北京市諾瓦克樣病毒抗體總檢出率為88.8％以上。太原市總檢出率在78.6％以上。1998-2002在福州地區(qū)用RT-PCR方法對(duì)288份腹瀉患者糞便標(biāo)本諾瓦克樣病毒病原檢測(cè)顯示，諾瓦克樣病毒基因組I的陽(yáng)性率為11.1％，主要是7歲以上兒童及成人；諾瓦克樣病毒基因組Ⅱ的陽(yáng)性率為28.8％，主要是6月齡至3歲嬰幼兒。我國(guó)流行現(xiàn)狀根本特征：發(fā)病率高、致病劑量低、抵抗力強(qiáng)，被WHO定為B類(lèi)病原體；對(duì)加熱、低溫具有較強(qiáng)抵抗性〔能耐受零度以下到60℃〕；對(duì)酸堿和去污劑等具有較強(qiáng)的抵抗性(通常10ppm或10mg/L含氯去污劑處理30分鐘不能有效殺滅病原體〕；無(wú)法培養(yǎng)，無(wú)有效小動(dòng)物模型；型別眾多，無(wú)有效保護(hù)性抗體，常引起重復(fù)感染；復(fù)制機(jī)制還不清楚，無(wú)有效治療藥物及疫苗病原學(xué)：

TaxonomyFamilyCaliciviridaeGenus: 1.Norwalk-LikeViruses(NLVs) 2.Sapporo-LikeViruses(SLVs)GenusNoroviruses (formerlyNorwalk-LikeViruses)GenusLagovirus(rabbit,hare)GenusVesivirus(cat,pig,sealion,other)GenusNorovirus(human,bovine,swine,mouse)GenusSapovirus(human,swine)Virions(35-40nm)nonenvelopedandicosahedral

Genomestructure：LinearpositivesenseRNAof7.4-7.7kb5'3'HelProPolORF1ORF2ORF3155358537469506950758876541789530212CapsidSource:GenBankM87661GIII.1_JenaGIII.2_CH126GI.3_DesertShieldGI.7_WinchesterGI.8_BoxerGI.4_ChibaGI.5_MusgroveGI.2_SouthamptonGI.6_HesseGI.1_NorwalkGV.1_MurineGIV.1_AlphatronGII.15_J23GII.4_BristolGII.11_SW918GII.8_AmsterdamGII.9_VirginiaBeachGII.14_M7GII.7_LeedsGII.12_WortleyGII.1_HawaiiGII.16_TiffinGII.2_MelkshamGII.5_HillingdonGII.10_ErfurtGII.13_FayettevilleGII.17_CS-E1GII.3_TorontoGII.6_Seacroft.10GVGIVGIIIGIIGIClustersdifferby≥20%aminoacidpairwisedistanceGenogroupsdifferby44-55%aminoacidpairwisedistance病毒的分型〔Capsidprotein)1病毒培養(yǎng)：Cellculture:no(humanstrains)Animalmodel:no(chimpanzees)流行現(xiàn)狀：Causesanestimated23millioninfectionsperyearintheUSCauses~60%ofillnessduetoknownAccountsfor70-95%ofgastroenteritisoutbreaks感染劑量:10-100viruses：傳播途徑：Fecal-oraltransmission(sheddingforupto2-3weeks)Droplettransmission?(viaingestionofairbornedropletsofviruscontainingparticles)

Commoncauseoftraveler’sdiarrheaMaycausechronicinfectionintransplantrecipients流行病學(xué)：傳播途徑：糞-口傳播

Person-to-personFoodborneWaterborneMixed空氣傳播

Vomitus污染物

傳播途徑分類(lèi)：臨床病癥： 腹瀉 86% 嘔吐 78% 腹部疼痛或絞痛 30% 惡心〔無(wú)嘔吐〕 15% 嗜睡 8% 發(fā)熱 7% 肌肉疼痛 7% 頭痛 6% 頭暈 4% 脫水 4% 寒顫 3% 喉嚨疼痛 1% 鼻出血 1% 感染持續(xù)過(guò)程：病毒顆粒持續(xù)釋放過(guò)程：診斷：實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

(一)抗原檢測(cè)

1972年首先通過(guò)免疫電鏡的方法發(fā)現(xiàn)NVs，因此該方法在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)成為檢測(cè)NVs的經(jīng)典方法。電鏡法包括常規(guī)電鏡〔EM〕、免疫電鏡〔IEM〕以及固相免疫電鏡〔SPIEM〕三種。直接電鏡法通過(guò)將糞便標(biāo)本重懸后離心，負(fù)染病毒顆粒后直接在鏡下觀察來(lái)尋找病毒。由于NVs病毒顆粒并不具備典型的杯狀病毒特征，且糞便中病毒滴度通常較低，給直接電鏡觀察帶來(lái)了很大困難，通常要求病毒的滴度到達(dá)106/g才能到達(dá)檢測(cè)要求。免疫電鏡的方法是將重懸離心別離得到的病毒顆粒與標(biāo)準(zhǔn)血清共孵育后再經(jīng)負(fù)染后在鏡下觀察來(lái)檢測(cè)病毒。盡管這種方法可以較好地濃縮病毒顆粒，但靈敏度仍然較低，對(duì)NVs檢測(cè)的陽(yáng)性率只有20%左右。固相免疫電鏡的方法是將特異性抗體直接包被載網(wǎng)，同時(shí)參加蛋白A增加抗體與標(biāo)本中抗原結(jié)合的時(shí)機(jī)，從而提高檢測(cè)的靈敏度。上述三種方法都要求觀察者具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)，精密的檢測(cè)儀器、較大的勞動(dòng)強(qiáng)度，都制約了該方法在NVs檢測(cè)中的應(yīng)用。免疫學(xué)檢測(cè)〔EIA〕主要通過(guò)檢測(cè)標(biāo)本中的抗原來(lái)確認(rèn)諾如病毒。該方法操作簡(jiǎn)單，實(shí)用性較強(qiáng)，便于推廣。然而同樣由于NVs型別的多樣性，對(duì)該方法的應(yīng)用產(chǎn)生了限制。Bruin等在2006年首次報(bào)告了對(duì)兩種新上市的商品化NVsEIA檢測(cè)試劑盒的評(píng)估結(jié)果。結(jié)果說(shuō)明，與傳統(tǒng)的RT-PCR方法相比，IDEIA和Ridascreen這兩個(gè)品牌的試劑盒對(duì)NVs的檢測(cè)靈敏度分別為38%和36%，特異性為96%和88%。之后的兩項(xiàng)評(píng)估結(jié)果雖然有提高，但靈敏度也僅在60.%76.9%和59%80.3%之間。說(shuō)明盡管對(duì)單個(gè)樣品的診斷可能還存在問(wèn)題，但可應(yīng)用于NVs大規(guī)模爆發(fā)后的篩查。(二)核酸檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響(RT-PCR)：除了能更準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)標(biāo)本中的諾瓦克病毒，尤其是低濃度的諾瓦克病毒感染外，最大的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)一步對(duì)病毒進(jìn)行血清型和基因型的研究，不會(huì)受到獲得分型單克隆抗體的限制，對(duì)流行病學(xué)研究具有重要意義，是諾如病毒檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)〞。SpecimenProcessing(Faeces)ViralRecovery&RNAextractionGeneratecDNAfromRNAbyreversetranscriptionPCRNorovirusGenogroupIorIIidentified

SequencingGenotyping實(shí)驗(yàn)流程：第三局部一起郵輪諾如病毒感染疫

情的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)根本情況介紹UnpublishedresultsbyWangJ.andZhangZ.實(shí)驗(yàn)室診斷處置依據(jù)：?上海國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心腹瀉病處置預(yù)案?診斷原那么首先排除檢疫傳染病〔霍亂〕流行病學(xué)調(diào)查資料臨床病癥其它相關(guān)資料確定檢測(cè)工程，檢測(cè)方法排查方案〔一〕〔一〕輪狀病毒：1．金標(biāo)法檢測(cè)輪狀病毒抗原試劑：糞便輪狀病毒檢測(cè)試劑盒；試劑廠家：法國(guó)VEDA公司；樣本：糞便；時(shí)間：30分鐘。2．ELISA法試劑：輪狀病毒酶免檢測(cè)試劑盒；供給商：上海軒昊科技開(kāi)展樣本：糞便；時(shí)間：2小時(shí)。3．熒光定量RT-PCR法試劑：輪狀病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒；單位：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所；樣本：糞便；時(shí)間：4小時(shí)?！捕持Z如病毒1．ELISA法檢測(cè)病毒抗原試劑：EnzymeimmunoassayforthedetectionofNorovirusinstoolsamples；廠家：R-BiopharmAG；樣本：糞便；時(shí)間：4小時(shí)。2．半定量RT-PCR法〔本實(shí)驗(yàn)室〕樣本：糞便；時(shí)間：6小時(shí)。排查方案〔二〕結(jié)果：E