土壤質(zhì)量 土壤微生物多樣性的測定 第2部分：磷脂脂肪酸分析法 征求意見稿

1GB/ZXXXXX—XXXX土壤質(zhì)量土壤微生物多樣性的測定磷脂脂肪酸分析法本文件描述了從土壤中僅提取磷脂脂肪酸(PLFA)的簡單方法。本文件適用于各種類型的土壤。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。ISO18400-206土壤質(zhì)量采樣第206部分：實(shí)驗(yàn)室微生物過程、生物量和多樣性評估用需氧條件下土壤的收集、處理和儲(chǔ)存（Soilquality—Sampling—Part206:Collection,handlingandstorageofsoilunderaerobicconditionsfortheassessmentofmicrobiologicalprocesses,biomassanddiversityinthelaboratory）ISO11465土壤質(zhì)量土壤干物質(zhì)和水分含量的測定重量分析法（Soilquality—Determinationofdrymatterandwatercontentonamassbasis—Gravimetricmethod）GB/T33087儀器分析用高純水規(guī)格及試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。BAME細(xì)菌酸甲酯（bacterialacidmethylester(s)）FA脂肪酸（fattyacid）EL-FA酯鏈脂肪酸（ester-linkedfattyacid）NEL-FA非酯鏈脂肪酸（non-ester-linkedfattyacid）FAME脂肪酸甲酯（fattyacidmethylester(s)）PL-FAME磷脂脂肪酸甲酯（phospholipidfattyacidmethylester(s)）ww土壤水分含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為每克干土中水的克數(shù)（g/gmassfractionofwaterinthesoil,ingramsofwaterpergramofdrysoil(g/g)）GC氣相色譜（gaschromatography）HPLC高效液相色譜（high-performanceliquidchromatography）5原理采用Bligh-Dyer提取法提取脂質(zhì)。通過柱層析法（硅膠固相萃取柱）將脂質(zhì)提取物分離為中性脂質(zhì)、糖脂和磷脂。磷脂通過溫和的堿性水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯(FAME)。使用氣相色譜法(GC)測定不同的FAME。上述流程的示意圖見圖1。2GB/ZXXXXX—XXXX6試驗(yàn)材料6.1土壤按照ISO18400-206的規(guī)定采集和制備土壤樣本。按照ISO11465的方法測定土壤中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ww。若樣本在新鮮狀態(tài)下過篩后未立即進(jìn)行分析，可以儲(chǔ)存在-20℃環(huán)境下或脂質(zhì)提取后保存在氯仿中（見7.1）。6.2試劑除非另有說明，本文件所有試劑均為分析純或指定的HPLC級(jí)，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T33087高純水的相關(guān)要求。6.2.1有機(jī)溶劑。6.2.1.1丙酮，C3H6O（HPLC級(jí)）。6.2.1.2氯仿，CHCl3（HPLC級(jí)）。6.2.1.3正己烷，C6H14（HPLC級(jí)）。6.2.1.4甲醇，CH3OH（HPLC級(jí)）。6.2.1.5甲苯，C7H8。6.2.2化學(xué)品3GB/ZXXXXX—XXXX6.2.2.12,6-二叔丁基對甲酚(BHT)，C15H24O。6.2.2.2檸檬酸，C6H8O7.H2O。6.2.2.3檸檬酸三鈉，C6H5Na3O7.2H2O。6.2.2.4水合硅酸，SiO2.nH2O（若使用自制柱）。6.2.2.5無水硫酸鈉，Na2SO4。6.2.2.6氫氧化鉀，KOH。6.2.2.7醋酸，C2H4O2。6.2.2.8氫氧化鈉，NaOH。6.2.2.9十九烷酸甲酯，C20H40O2。6.2.2.10氮?dú)猓琋2，純度≥99%。6.2.2.11氦氣，He，純度≥99.999%。6.2.3緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)溶液。6.2.3.1氯仿/甲醇(CM)溶液，向1:2的氯仿和甲醇溶液中加入2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)6.2.3.2檸檬酸鹽(CB)緩沖液，組分包括：——檸檬酸一水合物，0.15mol/L，稱取15.76gC6H8O7.H2O溶于500mL水中；——檸檬酸三鈉，0.15mol/L，稱取22.06gC6H5Na3O7.2H2O溶于500mL水中；——為使pH值為4，向41mL檸檬酸三鈉溶液中加入59mL檸檬酸溶液。6.2.3.3Bligh-Dyer(BD)溶液，向1:2:0.8的氯仿/甲醇/檸檬酸鹽緩沖液中加入2,6-二叔丁基對甲示例（100mL氯仿：200mL甲醇：80mLCB）+BHT。6.2.3.4甲醇?xì)溲趸浫芤海?.2mol/L，0.56g氫氧化鉀溶于50mL干燥甲醇（無水硫酸鈉），現(xiàn)用現(xiàn)配。6.2.3.5提取溶液(SE)，4:1的正己烷和氯仿（體積分?jǐn)?shù)）。6.2.3.6醋酸溶液，1mol/L，58ml/L。向750mL水中加入58mL醋酸，然后加水定容至1L。6.2.3.7氫氧化鈉溶液，0.3mol/L，12g/L。稱取12g氫氧化鈉溶于750mL水中，然后加水定容至1L。6.2.3.8內(nèi)標(biāo)溶液(C19:0FAME)，100mg/L，1mL正己烷中含10mg十九烷酸甲酯的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液用正己烷按1:100稀釋。6.2.3.9標(biāo)準(zhǔn)溶液(BAME)，市售BAME標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于定量分析。6.3設(shè)備常用的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和裝置6.3.1聚四氟乙烯管或玻璃管，配聚四氟乙烯蓋或帶聚四氟乙烯隔膜的蓋，約20mL。6.3.2巴斯德吸管。6.3.3燒瓶，容量為40mL，配帶聚四氟乙烯隔膜的蓋。6.3.4玻璃管，容量為20mL。4GB/ZXXXXX—XXXX6.3.5自制或市售硅膠柱，含500mg硅膠的固相萃取小柱?！郾┕埽?mL、5mL或10mL——無塵纖維。6.3.6通風(fēng)櫥。6.3.7超聲波儀。6.3.8離心機(jī)。6.3.9冰箱。6.3.10柱溫箱。6.3.11渦旋儀。6.3.12配有氮吹裝置的水浴鍋。6.3.13天平，精度1mg。6.3.14氣相色譜儀，配有火焰離子化檢測器或質(zhì)譜儀（用于定性），石英毛細(xì)管柱（最短30m，內(nèi)徑0.25mm，膜厚0.25μm）；載氣為氦氣。7分析步驟7.1脂質(zhì)提?。˙ligh-Dyer提?。┓Q取2g新鮮土壤(6.1)于20mL聚四氟乙烯管（或可替代物，6.3.1）中，加入11.9mLCM溶液（6.2.3.1），接著加入CB溶液（6.2.3.2），使含水量達(dá)3.16mL。CB溶液的體積按公式(1)計(jì)算。式中：VCB為CB溶液的體積，單位為毫升（mL）；ww為土壤水分含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為每克干土中水的克數(shù)。用渦旋儀(6.3.11)將樣品混勻，在超聲波儀（6.3.7）中超聲30min后放入冰箱（6.3.94℃下靜置過夜。渦旋樣品，在離心機(jī)（6.3.8）中以1,300r/min離心10min，將上層清液移入40mL燒瓶（6.3.3）中。向含土壤懸浮液的試管（6.3.1）中加入5mLBD溶液（6.2.3.3再次渦旋所得混合物，并以1,300r/min離心處理10min。將上清液移入之前的40mL燒瓶（6.3.3）中，重復(fù)此程序兩次。最后，向裝有上清液的燒瓶中加入4mL氯仿（6.2.1.2）和4mLCB溶液（6.2.3.2）使其分層。將燒瓶放入冰箱（6.3.94℃下靜置過夜。7.2使用硅膠柱分離脂質(zhì)制備用于脂質(zhì)分離的自制柱體前，需在100℃下活化0.5g的水合硅酸（6.2.2.4）1h。將無塵纖維放入10mL聚丙烯管（6.3.5用3mL氯仿（6.2.1.2）溶解活化過的水合硅酸并轉(zhuǎn)移到管中，讓氯仿?lián)]發(fā)干。依次將2mL甲醇（6.2.1.4）、2mL丙酮（6.2.1.1）和2mL氯仿（6.2.1.2）加入自制或市售的柱體。注意避免吸附劑在溶劑淋洗過程中干透。5GB/ZXXXXX—XXXX將脂質(zhì)提取物（7.1）用2×300μL氯仿溶出并加入柱體。依次向柱體加入5mL氯仿，12mL丙酮，并棄去所得的洗出物（分別含有中性脂質(zhì)和糖脂）。加入8mL甲醇（加甲醇前準(zhǔn)備好收集裝置將洗出的磷脂提取物收集到干凈的20mL帶刻度試管（6.3.4）中。在30℃下用氮?dú)獯蹈?。得到的組分可在?20℃下儲(chǔ)存3d，直至衍生化。7.3衍生-甲基化轉(zhuǎn)移-凈化將分離所得的樣品（7.2）溶解于0.5mL干燥甲醇（6.2.1.4）和0.5mL干燥甲苯（6.2.1.5）中。加入1mL甲醇?xì)溲趸浫芤海?.2.3.4），以進(jìn)行堿性甲醇分解。在渦旋儀中渦旋，并在37℃下保持至少30min。加入0.3mL醋酸(1M)（6.2.2.7）、5mLSE溶液（6.2.3.5）和3mL水，以停止反應(yīng)。在超聲波儀（6.3.7）中振搖30min，以1,300r/min離心5min，收集上層（有機(jī)相）。加入2mLSE溶液，再次提取下層（水相）（包括振搖和以1,300r/min離心5min的步驟），收集上層，合并兩次上層有機(jī)相，棄去水層。向提取液中加入3mL氫氧化鈉（6.2.3.7）溶液(12g/L)，以進(jìn)行最后的洗滌。振搖30s，以1,300r/min離心15min。使用巴斯德吸管將上清液通過過濾器（例如，含無塵纖維和無水硫酸鈉的聚丙烯管）轉(zhuǎn)移到干凈的帶刻度瓶中。用3mLSE溶劑再次萃取水層，以1,300r/min離心5min，再通過過濾器將上清液轉(zhuǎn)移到同一個(gè)瓶中。重復(fù)最后兩個(gè)步驟（即添加SE溶劑和離心并將三次提取物收集在同一瓶中，在40℃下用氮?dú)獯蹈?。冷凍保存?20℃)直到進(jìn)行氣相色譜分析（如果需要的話，保存一年）。7.4PLFA分析用50μL內(nèi)標(biāo)溶液（6.2.3.8）將提取物（7.3）溶解后待測。氣相色譜（6.3.14）的參考條件為：進(jìn)樣量2μL；進(jìn)樣口溫度200℃;載氣為氦氣（0.8mL/min柱溫箱（6.3.10）在180℃下啟動(dòng)并保持1min，以2℃/min的速度升溫至240℃,最后在240℃下保持1min。其它載氣（氫氣）、色譜柱和分析條件也能用來分離PLFA。通過與標(biāo)準(zhǔn)樣品（6.2.3.9）的保留時(shí)間比較來識(shí)別脂肪酸。土壤提取物中各FAME的含量按公式(2)計(jì)算。式中：c——土壤中目標(biāo)FAME的濃度，單位為納摩爾每克（nmol/gRf,Ri——目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)的平均響應(yīng)；k——目標(biāo)化合物相對于內(nèi)標(biāo)的校正因子，在響應(yīng)方面