制備型高效液相

1、制備型高效液相,制備型高效液相色譜是一種快速, 有效的分析分離工具。本文介紹了制備型高效液相色譜基礎(chǔ)理論及基本裝置, 介紹了樣品的預(yù)處理和應(yīng)用實(shí)例, 分析了目前制備型高效液相色譜技術(shù)存在的問題并對(duì)該技 術(shù)未來的發(fā)展進(jìn)行了展望。,高效液相色譜分析法,High performance liquid chromatography,一、液相色譜儀器,流程圖,近年來, 從自然資源中尋找具有生物活性化合物的探索 工作日益受到人們的關(guān)注。人們?cè)谶\(yùn)用高效的篩選方法, 從 植物、海洋生物及微生物中發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物的同時(shí)需要 一個(gè)快速、有效的分離方法以分離目標(biāo)化合物, 而色譜技術(shù) 是迄今人類掌握的對(duì)復(fù)雜混合物分

2、離效率最高的一種方法, 能夠分離物化性能差別很小的化合物1 。分析型H PLC 技 術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)就引起廣大研究者, 特別是分析化學(xué)工作者的高 度重視, 使這項(xiàng)技術(shù)在分析應(yīng)用方面取得了巨大成功?，F(xiàn)在 隨著人們大規(guī)模分離的需要, 制備型高效液相色譜技術(shù)也相 應(yīng)產(chǎn)生了, 并受到了人們?cè)絹碓綇V泛的重視。在我國, 該技 術(shù)已被列入 863 工程生物技術(shù)領(lǐng)域的攻關(guān)項(xiàng)目中 2。由于 技術(shù)上的原因, 長期以來制備型液相色譜技術(shù)發(fā)展緩慢, 但 是隨著理論研究的深入, 新穎的填料、新的填充方法以及在 儀器和流程上的進(jìn)展, 近年來該技術(shù)獲得了很大的發(fā)展。,1基礎(chǔ)理論 人們對(duì)色譜基礎(chǔ)理論進(jìn)行不懈的研究, 提出了眾多的理

3、 論。其中比較著名的有: 1. 平衡色譜理論。在1940 年由 W ilson 3 提出, 該理論認(rèn)為在整個(gè)色譜過程中, 組分在流動(dòng) 相和固定相之間的分配平衡能瞬間達(dá)成; 2. 塔板理論。在 1941年由M a rtin和Syng e 4提出, 該理論將色譜過程比擬為 蒸餾過程, 把色譜柱看成是由一系列平衡單元! 理論塔板所 組成。在每一個(gè)塔板高度內(nèi), 組分在流動(dòng)相和固定相之間的 分配平衡能瞬間達(dá)成; 3. 縱向擴(kuò)散理論。由Am undson 5 等人通過大量實(shí)驗(yàn)提出, 該理論認(rèn)為在色譜過程中, 組分在流動(dòng) 相的軸向擴(kuò)散是影響色譜區(qū)域譜帶擴(kuò)張的主要因素, 而有限 的傳質(zhì)速率對(duì)區(qū)域譜帶擴(kuò)張沒有影

4、響; 4. 速率理論。該理論 認(rèn)為組分在流動(dòng)相和固定相之間有限的傳質(zhì)速率是影響色譜 區(qū)域譜帶擴(kuò)張的主要因素, 而軸向擴(kuò)散的影響可以忽略; 5. 雙 膜理論。Funk等人把流動(dòng)相和固定相看成是兩塊相互緊密接 觸的平面薄膜, 整個(gè)傳質(zhì)阻力為流動(dòng)相膜的傳質(zhì)阻力和固定 相膜的傳質(zhì)阻力所構(gòu)成, 組分在界面接觸處達(dá)到分配平衡。,簡單大男,制備分離的色譜模型和分析分離的模型相似, 但在具體 操作中兩者的指導(dǎo)思想?yún)s有著本質(zhì)的不同。在制備分離中, 人們總是希望在盡可能短的時(shí)間里得到盡可能多的純組分。 欲得到負(fù)載必須以分離效果為代價(jià), 即在保持最低分辨率的 前提下, 使柱子超載以得到最大的物料通過量。而分析分離

5、中在最短時(shí)間里得到最大的分離效率則是人們希望得到 的 6 。制備分離選擇的是高柱效、高柱容量的色譜柱, 而且 使色譜柱在超載狀態(tài)下工作。所謂超載, 通常將理論塔板數(shù) 下降10%時(shí)柱容量 7。較為理想的制備條件的選擇包括上 柱量, 容量因子, 選擇性以及柱效 8。,2 基本裝置 制備型H PLC是一種基于組分在固定相( 柱填料) 和流 動(dòng)相(淋洗液)中分配系數(shù)的微小差異, 當(dāng)二相作相對(duì)運(yùn)動(dòng) 時(shí), 樣品中的各組分將形成不同的遷移速度的譜帶而實(shí)現(xiàn)分 離的新型高效分離技術(shù)。對(duì)于制備型HPLC而言, 裝置不像對(duì)分析型HPLC那樣關(guān)鍵, 使用不很高級(jí), 價(jià)格較低的裝置 往往可以獲得令人滿意的分離效果。 制

6、備型HPLC裝置主要由輸液泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱、檢 測(cè)器、餾分收集器、數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)等部分組成。,2. 1輸液泵 在制備型HPLC 不需要具有很高的輸送壓力, 一般為 19. 6MPa。輸液泵采用的是恒流的機(jī)械往復(fù)泵或恒壓的氣動(dòng) 放大泵較理想, 因?yàn)樗鼈兙哂休^高的輸送速率和連續(xù)輸出溶 劑的能力。然而當(dāng)采用裝入小顆粒固定相的粗柱進(jìn)行制備 型HPLC時(shí), 例外地需用能提供較大壓力的泵。在某些場(chǎng) 合, 所需壓力高達(dá)150bar, 此時(shí)采用薄膜泵較合適。對(duì)于內(nèi) 徑較小的制備柱可使用分析型的輸液泵, 內(nèi)徑較大的制備 柱, 輸液泵所需的輸送能力可從分析型柱子所做的實(shí)驗(yàn)條件 參數(shù)計(jì)算出來。,2. 2進(jìn)樣

7、系統(tǒng) 在制備型H PLC分離中, 可以采用一個(gè)進(jìn)樣閥(如六通 進(jìn)樣閥) 將較大量的樣品方便的注入柱子而不影響流動(dòng)相流 動(dòng)。通過更換樣品環(huán)可以方便的改變進(jìn)樣量, 最大可達(dá) 10mL。如果使用注射器, 一般采用停留進(jìn)樣技術(shù), 即樣品在 常壓下注入, 然后再從新起動(dòng)泵。若樣品量非常大, 可以采 用停留技術(shù), 借助于一臺(tái)小體積泵將樣品定量地注入柱中。 也可采用隔膜進(jìn)樣法, 用注射器將樣品定量地注入柱中。,2. 3色譜柱 相對(duì)于分析型色譜, 制備色譜的核心就是色譜柱。為提 供既穩(wěn)定又高效的色譜柱, 并用小尺寸顆粒進(jìn)行填充, 最常 用也是最易實(shí)現(xiàn)的效果較為理想的是動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱 ( DACTM )技術(shù) 9

8、 。DAC技術(shù)為使用者提供了用任一種填料 自己裝填色譜柱、方便快速地調(diào)整柱長度的可能性。在制備 型HPLC中, 色譜柱的內(nèi)徑可在100 500mm 之間。一般增 大色譜柱的直徑意味著可以承載更多的樣品, 從而增加產(chǎn) 量。增加色譜柱的長度則意味著可加入的樣品量和分辨率 的增大, 但同時(shí)也增加了柱壓。研究表明對(duì)于難分離物系, 可以采用直徑較小的色譜填料, 以提高分離效率, 但在分離 度可以滿足分離要求的前提下, 使用較大直徑的色譜填料將 更為有利 10 。,2. 4檢測(cè)器 在現(xiàn)有的檢測(cè)器中, 示差折光檢測(cè)器通常適用于制備分 離, 不過在某些系統(tǒng)中為了準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品中所有峰, 往往 需要將示差與紫外

9、分光光度檢測(cè)器配合使用。也可用薄層 色譜對(duì)高濃度的流出液各流分進(jìn)行檢測(cè), 所以當(dāng)其他檢測(cè)方 法不適用時(shí), 可求助于薄層色譜檢測(cè),2. 5餾分收集器,在制備型分離工作中, 需使用大量的洗脫溶劑, 因此要 采用適當(dāng)?shù)氖占?。若收集一個(gè)或幾個(gè)已分離的組分, 用手 動(dòng)餾分收集器即可。然而當(dāng)大量樣品組分必須一次分離或 為了提高一個(gè)或多個(gè)組分的收集量而要進(jìn)行多次重復(fù)性分 離, 使用自動(dòng)餾分收集器更為方便。 如有可能, 應(yīng)對(duì)溶劑回收再用, 因而也應(yīng)盡量不使用混 合溶劑 11 。在使用反相或聚合物吸附進(jìn)行分離時(shí), 有時(shí)從 水液中回收樣品較困難。一種解決辦法是蒸除其中的有機(jī) 溶劑, 然后用甲苯或氯仿提取殘留水液

10、,2. 6數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng),國外的一些公司已經(jīng)相繼開發(fā)出商業(yè)化的具有某些人工智能特點(diǎn)的制備型HPLC 整套設(shè)備。這些整套設(shè)備均是 采用一臺(tái)計(jì)算機(jī)控制整個(gè)儀器的運(yùn)轉(zhuǎn), 并進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集、 貯存和處理等工作, 從而使制備型H PLC 的分離速度以及自 動(dòng)化程度等大為提高。,3 應(yīng)用 3. 1制備型HPLC的樣品預(yù)處理,在高壓液相色譜進(jìn)樣之前, 需對(duì)樣品進(jìn)行過濾。使用能 套在注射器上的濾片可以除去樣品中混有的顆粒狀雜質(zhì), 既 方便又廉價(jià)。顆粒狀雜質(zhì)可能損壞高壓液相色譜儀的閥門, 阻塞管道或柱子入口端的濾板。濾片可以是不銹鋼或塑料 套的, 但通常用一次性的聚丙烯外殼的濾片。這種濾片一般 有凹陷的入口

11、及一細(xì)凹的出口, 可與注射器相連。過濾膜的 材料可以是聚四氟乙烯、乙酸纖維、尼龍、紙或無機(jī)膜。在選 用過濾膜時(shí)應(yīng)注意使其適合于所用的溶劑, 這一點(diǎn)在使用含 四氫呋喃的溶劑時(shí)尤其重要 12 。 在色譜柱與進(jìn)樣器之間安裝前置柱可除去顆粒狀雜質(zhì) 和吸附性強(qiáng)的樣品組分。前置柱通常裝有少量與色譜柱相 同的填料, 如填充得當(dāng), 對(duì)系統(tǒng)分離效果不會(huì)造成很大影響。 硅膠預(yù)處理柱可防止含有緩沖鹽或堿的流動(dòng)相所引起 的麻煩, 上訴物質(zhì)可破壞鍵合相填充料的硅膠骨架, 常會(huì)在 柱的上部形成空隙。預(yù)處理柱安裝在泵與進(jìn)樣器之間, 這樣 盡管流動(dòng)相被硅膠所飽和, 但在進(jìn)樣途中不會(huì)有空隙或氣泡,3. 2制備規(guī)模,按照分離一次

12、進(jìn)樣量的多少, 制備型HPLC 有3 種規(guī) 模, 即半制備級(jí)H PLC、克級(jí)H PLC 和工業(yè)級(jí)HPLC,如下表1所示。,制備型H PLC以生產(chǎn)純物質(zhì)為目的, 在經(jīng)濟(jì)合理的前提下, 規(guī)模越大越好,醫(yī)學(xué)壓力,演示文稿,3. 3柱超載方式 分析型HPLC與制備型HPLC的根本區(qū)別在于分離目的 不同 13 。在分析型中, 需要的是反映樣品組成的信息, 不需 要收集達(dá)到特定純度的餾分, 洗提液通常是作為廢液來考慮 的。但在制備型HPLC 中, 為了節(jié)省投資和操作費(fèi)用, 必須 以最少的時(shí)間生產(chǎn)最大量的產(chǎn)品。由于目的不同, 制備型 HPLC與分析型HPLC所選用的操作方式有顯著不同。前者 要求進(jìn)樣量越小越

13、好, 而后者為了提高制備量, 柱必須超載。 柱的超載方式有兩種, 一種是所謂的 質(zhì)量超載 , 即維持較 小的進(jìn)樣體積, 但提高進(jìn)樣濃度; 另一種是所謂的體積超 載 , 即保持較小的進(jìn)樣濃度, 但增加進(jìn)樣體積。在制備型 HPLC中, 一般認(rèn)為采用質(zhì)量超載的方式較好。王志祥 14 等 人建立的混合池模型可以較好的描述制備型H PLC 分離過 程, 發(fā)現(xiàn)在制備型H PLC 分離過程中, 分離度和柱效均隨質(zhì) 量超載程度的增加而下降。但是, 在分離度可以滿足分離要 求的前提下, 采用質(zhì)量超載的方式操作, 可以提高制備量。,3. 4流動(dòng)相 進(jìn)行制備型液相色譜分離時(shí), 所用溶劑的純度很重要。 即使含純化合物

14、的流動(dòng)相溶劑中含有微量的不揮發(fā)性雜質(zhì),當(dāng)大量溶劑經(jīng)蒸發(fā)后, 其雜質(zhì)濃度就會(huì)增高。制備型液相色 譜往往需消耗大量溶劑, 因此應(yīng)在溶劑純度與所用數(shù)量之間 進(jìn)行權(quán)衡。流動(dòng)相中的非揮發(fā)性添加劑會(huì)在產(chǎn)物回收時(shí)引 起麻煩, 這是可采用揮發(fā)性緩沖物來改進(jìn)分離效果, 又易于 將其除去。,3. 5洗脫 制備型H PLC 所采用的洗脫方式主要有兩種。一種是 維持流動(dòng)相的熱力學(xué)參數(shù)不變的等度洗脫法; 一種是改變流 動(dòng)相的一種或幾種熱力學(xué)參數(shù)的梯度洗脫法,3. 6被分離物質(zhì)的收集 在制備型分離工作中, 需使用大量的洗脫溶劑, 因此要 采用適當(dāng)?shù)氖占?。如有可? 應(yīng)對(duì)溶劑回收再用, 因而也 應(yīng)盡量不使用混合溶劑。在使

15、用反相或聚合物吸附劑進(jìn)行 分離時(shí), 有時(shí)從水液中回收樣品較困難。一種解決辦法是蒸 除其中的有機(jī)溶劑, 然后用甲苯或氯仿提取殘留水液。 如以甲醇- 水為洗脫液, 可將收集的流分用水稀釋5 倍, 用泵加回到色譜柱上, 然后用甲醇將化合物洗脫下來。 如從環(huán)肽中脫鹽時(shí), 先用水洗脫重新加到柱上的流分, 然后 用純甲醇洗脫所需成分另一種方法是將收集的樣品加到 Sephadex LH - 20柱上, 如Seto 等 15 在從植物薔薇中分離黃 酮苷時(shí), 采用此法以水洗除H PLC 洗脫液中含有的磷酸, 而 后用甲醇將純化合物洗下。 目前的發(fā)展趨勢(shì)是實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣與流分收集的自動(dòng)化, 這樣 可進(jìn)行連續(xù)的操作及反復(fù)

16、的分離 16 。,4在天然產(chǎn)物研究中的應(yīng)用實(shí)例,肖偉濤, 朱小蘭等人用制備高效液相色譜技術(shù)對(duì)25%茶葉提取物中茶氨酸進(jìn)行制備、分離純化。所得產(chǎn)品用外標(biāo)法定量分析, 純度大于98%, 制備收率大于60% 17 。彭密軍,周春山等人采用制備型H PLC 分離純化, 制備回收率為83.3%, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3. 1%, 綠原酸的純度達(dá)98. 61%, 同時(shí)可得到杜仲葉黃酮、桃葉珊瑚甙等副產(chǎn)品18 。徐光國 19 運(yùn)用國產(chǎn)YZS- 3型制備液相色譜儀分離制備了抗癌藥葫蘆素B標(biāo)準(zhǔn)品, 茯苓三萜酸成分和金銀花中的主要成分綠原酸;陳若蕓 20 等用制備液相色譜技術(shù)制備了靈芝中的三萜類化合物; 張仁斌 21

17、等用該技術(shù)對(duì)青蒿素異構(gòu)體進(jìn)行了分離制備。李軍等用制備型H PLC 對(duì)曲克蘆丁原料進(jìn)行分離純化制得曲克蘆丁對(duì)照品, 純度可達(dá)99%以上 22 。仲英等利用高效液相色譜Deltaprep 3000制備系統(tǒng)純化藥典用葛根素對(duì)照品 23 。陳曉輝等利用制備型HPLC對(duì)野菊花的黃酮類化學(xué)成分進(jìn)行分離研究, 分離純化了6個(gè)化學(xué)品, 純度均為99%以上24。尚慶坤等使用制備型H PLC 法分離虻蟲中的多肽樣品, 制備收集了4 種主要組分, 經(jīng)檢測(cè)各組分達(dá)到很高純度 25 。彭密軍等使用制備HPLC從杜仲樣品中同時(shí)制備了AU、GPA、GP3種單體 26 。,5結(jié)語,與其他制備方法相比, 液相色譜是目前技術(shù)手段最成 熟、應(yīng)用最為廣泛的一種。但是它的缺點(diǎn)也很明顯 27 , 如需 消耗大量溶劑、產(chǎn)品過于稀釋以及往往無法避免有毒溶劑的 使用。另外色譜技術(shù)的最大弱點(diǎn)是定性能力差。因此將分 離手段和分析手段聯(lián)合成為一個(gè)整體, 再配上專用的計(jì)算 機(jī), 已成為近代分析儀器發(fā)展的又一個(gè)重要方向。當(dāng)前對(duì)各 種檢測(cè)手段及聯(lián)機(jī)的接口, 都還趨于摸索階段或者只適用于某些領(lǐng)域, 例如H PLC - AAS ( 原子吸收)、HPLC - LC ( 質(zhì) 譜)、HPLC- 化學(xué)發(fā)光法、HPLC - 化學(xué)發(fā)光法、HPLC - 電