分解纖維素的微生物的分離

1、,纖維素： 棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物；,纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過70億噸；分布植物的根、莖、葉中；,1、在草食性動(dòng)物等的消化道內(nèi)，也共生有分解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。 2、農(nóng)作物秸稈：米秸、麥秸、稻草、草、木屑 等富含大量的纖維素，被利用的機(jī)會(huì)很少、效率低；,纖維素生物燃料：最有希望替代石油能源,科學(xué)家正致力于研究，怎樣將農(nóng)業(yè)廢棄物、木材及生長更為迅速的草本植物，轉(zhuǎn)化為種類繁多的生物燃料（甚至是航空燃油）。,課題3分解纖維素的微生物的分離,（一）纖維素與纖維素酶,纖維素：一種由葡萄糖首尾相

2、連而成的高分子化合物，廣泛地存在于植物的根、莖、葉等器官中。,纖維素酶：由微生物分泌的一種復(fù)合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它們的協(xié)同作用，最終將纖維素分解成葡萄糖。,纖維素,纖維二糖,葡萄糖,取二支20mL的試管,實(shí)驗(yàn)：纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn),各加入一張濾紙條,各加入10mL0.1mol/L的醋酸 醋酸鈉緩沖液,甲 乙,在甲試管中加入1mL蒸餾水，,乙試管加入1mL纖維素酶,將試管放在140r/min的搖床上振蕩1h,結(jié)果：乙試管的濾紙條消失,討論： 乙試管的濾紙條為什么會(huì)消失？甲試管的作用是什么？,剛果紅染色法,剛果紅能與像纖維素的多糖形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡

3、萄糖發(fā)生該反應(yīng)。,（二）纖維素分解菌的篩選,用加入剛果紅的纖維素培養(yǎng)基去培養(yǎng)微生物時(shí)，如果培養(yǎng)基中出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈時(shí)，可說明該菌落是纖維素分解菌，因?yàn)樗褜⒈粍?果紅 染成紅色的纖維素分解了。,一、實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì),請(qǐng)你根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程圖和提供的三個(gè)資料以及“操作提示”，在思考有關(guān)問題的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出一個(gè)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。,*,取樣環(huán)境,1、土壤取樣：,富含纖維素的環(huán)境（樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等）,操作步驟,討論:如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋在土壤中多深？,將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對(duì)集中，實(shí)際上是人工

4、設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。,2、選擇培養(yǎng),增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。,目的：,制備選擇培養(yǎng)基,操作： P29,培養(yǎng)基成分分析,提示： 自變量為培養(yǎng)基的種類，即完全培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。 可用完全培養(yǎng)基做對(duì)照,或?qū)⒗w維素改為葡萄糖。,A、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？,是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）,B、這個(gè)培養(yǎng)基對(duì)微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進(jìn)行選擇的？,有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。,C、你能否設(shè)計(jì)一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，說明選擇培

5、養(yǎng)基的作用,說明：分析“纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方”可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長繁殖。但因酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。,在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)該營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。,為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需微生物？,按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋101107倍。,3.梯度稀釋,4.將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上,（1）制備鑒別培養(yǎng)基P29,（2）涂布平板： 將稀釋度為104106的菌

6、懸液各取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，30倒置培養(yǎng)。,鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基,(水溶性羧甲基纖維素鈉),方法一：先 ，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。 方法二：在 時(shí)就加入剛果紅。,培養(yǎng)微生物,倒平板,5.剛果紅染色法,挑選產(chǎn)生透明圈的菌落 即為分解纖維素的菌落。,這兩種方法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？,有透明圈的基本是能分解纖維素的微生物,操作繁瑣 剛果紅會(huì)使菌落之間發(fā)生混雜,操作簡便不存在菌落混雜問題,1.產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈 2.有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。,方法一中NaCl溶液的作用？,思考：,漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以

7、判斷酶活力的大小，實(shí)際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細(xì)菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個(gè)多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當(dāng)然分解纖維素的能力就強(qiáng)！,土壤取樣,選擇培養(yǎng),梯度稀釋,將樣品涂布到鑒別培養(yǎng)基,挑選菌落,什么樣的環(huán)境取樣?, 培養(yǎng)的目的? 選擇培養(yǎng)基的特點(diǎn)?,挑選什么樣的菌落?,鑒別培養(yǎng)基特點(diǎn)? 如何鑒別?,根據(jù)：微生物對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)環(huán)境中去找；,增加纖維素分解菌濃度，確保能夠從樣品中分離到纖維素分解菌； 液體培養(yǎng)基,是固體培養(yǎng)基 剛果紅染色法,實(shí)驗(yàn)回顧,挑選有透明圈的菌

8、落,在產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C 370C培養(yǎng)，可獲得純化培養(yǎng)。,純化培養(yǎng),四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià),1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對(duì)照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。 2.分離的結(jié)果是否一致 由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。,為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行_實(shí)驗(yàn)，纖維素酶的發(fā)酵方法有_ 發(fā)酵和_ 發(fā)酵。纖維素

9、酶測(cè)定方法是對(duì)纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的_ 含量進(jìn)行定量測(cè)定。,發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶,液體,固體,葡萄糖,五、課題延伸,思考：本實(shí)驗(yàn)課題2中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？,課題2將土樣梯度稀釋液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基上，分離并統(tǒng)計(jì)菌落。 本課題先選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再稀釋涂布在鑒別培養(yǎng)基上，挑選菌落。,土壤取樣,選擇培養(yǎng),梯度稀釋,將樣品涂布到鑒別培養(yǎng)基,挑選菌落,什么樣的環(huán)境取樣?, 培養(yǎng)的目的? 選擇培養(yǎng)基的特點(diǎn)?,挑選什么樣的菌落?,鑒別培養(yǎng)基的特點(diǎn)? 如何鑒別?,根據(jù)：微生物對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)環(huán)境中去找；,目的：增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分

10、離到所需要的微生物；,剛果紅染色法,分解纖維素的微生物的分離,纖維素酶,種類、作用、催化活力,剛果紅染色,篩選原理,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),土壤取樣,選擇培養(yǎng),涂布培養(yǎng),純化培養(yǎng),前置染色法 后置染色法,富含纖維素土壤,增大分解菌含量,染色鑒別,分離出分解菌,課堂總結(jié),DNA重組技術(shù),下列不屬于微生物的是 ( ) A藍(lán)藻和蘑菇 B葫蘆蘚和鐵線蕨 C噬菌體和黃曲霉 D放線菌和變形蟲 【解析】病毒、原核生物(例如細(xì)菌、放線菌、支原體、藍(lán)藻)、真核類的藻類和真菌及原生動(dòng)物都是微生物。而一般多細(xì)胞的植物與動(dòng)物不屬于微生物，如葫蘆蘚是苔蘚植物，鐵線蕨是蕨類植物，都屬于多細(xì)胞高等植物。 【答案】B,微生物營養(yǎng)物質(zhì),有關(guān)

11、微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是（ ） A是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源 B凡碳源都提供能量 C除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽 D無機(jī)氮源也能提供能量 【解析】不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對(duì)微生物的具體情況具體分析。對(duì)于A、B選項(xiàng)，它的表述是不完整的。有的碳源只能是碳源，如CO2；有的碳源可同時(shí)是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時(shí)是能源，如葡萄糖；有的碳源同時(shí)是氮源，還是能源，如蛋白胨。對(duì)于C選項(xiàng)，除水以外的無機(jī)物種類繁多，功能也多樣。如CO2可作自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3可作自養(yǎng)型微生物的碳源和無機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無機(jī)鹽。對(duì)于D選項(xiàng)，無機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的

12、，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。 【答案】D,微生物與病毒的關(guān)系,關(guān)于病毒增殖的敘述中，正確的是（ ） A病毒侵入宿主細(xì)胞后，合成一種蛋白質(zhì) B病毒的繁殖只在宿主的活細(xì)胞中進(jìn)行 C病毒的繁殖以核衣殼為單位 D在普通的培養(yǎng)基上能培養(yǎng)病毒 【解析】解答此題需從以下幾方面入手分析：首先，病毒是營寄生方式生活，必須生活在活的細(xì)胞內(nèi)，不能獨(dú)立生活，所以在普通的培養(yǎng)基上不能生活。第二，繁殖時(shí)，病毒的核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞，利用宿主的成分合成子代個(gè)體，除了核衣殼，還應(yīng)包括該病毒的其他結(jié)構(gòu)。合成的蛋白質(zhì)不只是一種，應(yīng)該是多種，包括多種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)及物質(zhì)合成時(shí)所需的多種酶。 【答案】B,培養(yǎng)基的種類,要從多種細(xì)菌中分離某種細(xì)菌，培養(yǎng)基要用（ ） A加入青霉素的培養(yǎng)基 B加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基 C固體培養(yǎng)基 D液體培養(yǎng)基 【解析】微生物的分離需使用固體培養(yǎng)基，由于某種細(xì)菌的種類不明，所以難以使用選擇培養(yǎng)基，如加入青霉素的培養(yǎng)基可以分離到酵母菌和霉菌，加入高濃