培養(yǎng)基的制備與滅菌

1、培養(yǎng)基的制備與滅菌,一、目的與要求： 1、了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握制備培養(yǎng)基的過程。 2、學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌操作技術(shù)。 3、了解干熱滅菌操作要點(diǎn)。,二、原理及說明:,培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。一般來說，培養(yǎng)基包括有水份、碳源、氮源、無機(jī)鹽類以及生長因素等五大類營養(yǎng)成份。此外還得有適宜的PH值，一定的滲透壓（即濃度）以及氧化還原電位等。,1、培養(yǎng)基的分類,（1）根據(jù)培養(yǎng)基原料來源不同：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基 （2）根據(jù)物理性狀分為：液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基 （3）根據(jù)培養(yǎng)目的不同：鑒別培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基,2

2、、培養(yǎng)基的配制,（1）稱藥：按下列培養(yǎng)基的配方準(zhǔn)確稱取各成分，其中牛肉膏放在小燒杯里稱量，其他成分放在稱量紙上稱量。 阿斯畢無氮培養(yǎng)基： 甘露醇（或蔗糖、葡萄糖） 10g KH2PO4 0.2g MgSO4.7H2O 0.2g NaCl 0.2g CaSO4.2H2O 0.1g CaCO3 5g 瓊脂 20g 水 1000ml PH 自然 121oC 滅菌30分鐘,（2）溶化： 用燒杯先裝少許水,依次將藥品倒入鋁鍋中，加足水，然后在電爐上加熱溶化。 （3）PH值： 用精密的PH試紙測定，并用1%氧化鈉或5%鹽酸調(diào)節(jié)到所需的PH值。 （4）過濾： 趁熱用紗布將培養(yǎng)基進(jìn)行過濾。 （5）分裝： 過濾

3、后根據(jù)不同需要，立即趁熱裝入試管或三角瓶等容器中，分裝如圖：,注意事項：,（1）不要使培養(yǎng)基沾在管口，如沾上，需用干凈的紗布擦干凈。 （2）液體培養(yǎng)基：分裝高度以試管的1/4左右為宜。 （3）固體培養(yǎng)基：分裝試管，其裝量為管高的1/61/5滅菌后制成斜面。分裝三角瓶容量之一半為宜。 （4）半固體培養(yǎng)基：分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后，垂直待凝成半固體深層瓊脂。,（6）做棉塞,裝好培養(yǎng)基的試管都要加上棉塞，這樣既可過濾空氣，避免雜菌侵入，又可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，制棉塞的方法多種，形狀各異，總原則如下： （1）用脫脂棉制作（脫脂棉花易吸水） （2）松緊適合 （3）塞頭不要太大，一般為

4、球狀。 （7）包裝 試管口或三角瓶口棉塞部分，用牛皮紙扎，以防滅菌時水蒸氣打濕棉塞。,（8）滅菌,滅菌是指殺死物品上或環(huán)境中的所有微生物。 滅菌方法可分為四種：物理滅菌、機(jī)械滅菌、化學(xué)滅菌和生物滅菌。 物理滅菌：1、熱力滅菌： 2、紫外光滅菌：一般應(yīng)用于無菌室和接種箱的滅菌。,熱力滅菌：,干熱滅菌：適用于玻璃儀器，將物品放入烘箱，160170oC，12小時。 火焰滅菌：適用于常用用具，如接種環(huán)、鑷子等。滅菌方法是放在火焰上直接灼燒。 濕熱滅菌：(1)高壓蒸汽滅菌：適用于培養(yǎng)基、衣物等的滅菌。 （2）間歇蒸汽滅菌：適用于不耐高溫的培養(yǎng)基或無高壓蒸汽滅菌鍋時。 （3）巴斯德滅菌：適用于牛乳類等不耐

5、高溫的物體。 紫外光滅菌：一般應(yīng)用于無菌室和接種箱的滅菌。,原理與區(qū)別,基本原理：即通過不同的加熱方法，使微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到滅菌的目的,蛋白質(zhì)的凝固變性與蛋白質(zhì)中含水量的多少有關(guān)，含水量較多者，其凝固所需要的溫度低，反之，含水份較少者需要高溫才能使蛋白質(zhì)凝固。因此殺滅芽孢比殺滅營養(yǎng)體所需的溫度高。 干熱滅菌與濕熱滅菌的區(qū)別：在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固，同時水蒸汽穿透力強(qiáng)，水蒸汽的導(dǎo)熱性也強(qiáng)。而且當(dāng)蒸汽與被滅菌的物體接觸凝為水時，又可放出熱量，使被滅菌物體溫度迅速增高，從而增加滅菌效力。,高壓蒸汽滅菌,高壓蒸汽滅菌鍋是一個

6、耐高壓又密閉的金屬鍋。它是利用在密閉條件下產(chǎn)生高壓蒸汽來達(dá)到滅菌的效果。其溫度在100oC以上，有強(qiáng)大的殺菌能力。因此它是一種用途廣泛，效率高的滅菌工具。 分類：1、臥式 2、立式 具體操作步驟： （1）加入適量自來水于滅菌鍋中（至水位線） （2）擺入上述包裝好的待滅菌的培養(yǎng)基，注意：不要擺得太擠，以免影響蒸汽流通和滅菌效果。 （3）加蓋旋緊螺旋，使蒸汽鍋密閉不漏氣（對角線均勻擰旋）,（4）打開放氣閥，打開電源，自開始產(chǎn)生蒸汽后10分鐘（此時蒸汽鍋內(nèi)的冷空氣由排氣閥排盡）關(guān)緊放氣閥，讓溫度隨蒸汽壓力上升而上升，當(dāng)達(dá)所需壓力時（15磅/時2）控制熱源維持所需時間（30分鐘）然后停止加熱，讓其自然

7、冷卻。 （5）待壓力降至0磅時，打開排氣閥，再打開鍋蓋，取出滅菌物。 注意：壓力未降至0磅時，切勿打開鍋蓋，否則突然降壓，招致培養(yǎng)基沸騰，沾濕棉塞，甚至沖出管外。 （6）自鍋中取出滅菌好的培養(yǎng)基，放置稍冷卻后擺成斜面，而后至37oC恒溫箱培養(yǎng)24小時，無菌生長，方可保存?zhèn)溆谩?應(yīng)用此法滅菌是否徹底的一個重要關(guān)鍵是在壓力上升之前，必須將鍋內(nèi)的冷空氣完全排盡，否則雖然壓力表已指15磅/時，但鍋內(nèi)的溫度還只有100oC，結(jié)果往往造成滅菌不徹底。,斜面擺放示意圖：,無菌水的制備：,用10ml量筒量取9.0的自來水，裝入18*180的中號試管中，用100ml量筒量取99ml的自來水裝入250ml的三角瓶

8、中，做好棉塞，用牛皮紙包好，高壓滅菌，備用。,移液管、培養(yǎng)皿的干熱滅菌：,（1）在移液管尾部塞上少許脫脂棉花，然后用報紙條包好。 （2）用報紙條包好干燥的培養(yǎng)皿。 （3）將已包好的移液管、培養(yǎng)皿放入電烘箱干熱滅菌。干熱滅菌是在恒溫電箱中進(jìn)行，它是利用高熱空氣來達(dá)到滅菌效果，因此稱干熱滅菌。適合玻璃器皿和金屬用具的滅菌。帶有膠皮的物品，含水份的物質(zhì)，培養(yǎng)基等不可用這種方法。,操作步驟：,（1）將待滅菌物品包扎好，均勻放入烘箱內(nèi)，注意不要擺的太擠，以免妨礙氣流流通。 （2）打開鼓風(fēng)機(jī)、開啟電源，當(dāng)溫度100oC時，關(guān)閉通氣孔，調(diào)溫度至160oC，借恒溫調(diào)節(jié)器的自動控制調(diào)節(jié)器，保持此溫度12小時。

9、（3）中斷電源，待溫度降至70oC以下時，打開箱門，取出滅菌物品。,4人一組：（按學(xué)號分組）,培養(yǎng)皿：每人包5皿。 吸管；10支/組。 干熱滅菌 99ml無菌水（玻璃珠），1瓶/組。 9ml的無菌水，8支/組。（試管） 培養(yǎng)基：220250ml/500ml三角瓶.（2瓶/組） 值日：912,培養(yǎng)基配制步驟與配方：,1、稱藥 2、溶化 3、PH值 4、過濾 5、分裝 6、做棉塞 7、包裝 8、滅菌,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 瓊脂 20g 水 1000ml PH 7.07.2 121oC 滅菌20分鐘,試驗完成步驟：（4人一組）,1、每支試管中加入9ml自來水。8支/組 2、裝有玻璃珠的三角瓶裝入99ml自來水。 3、培養(yǎng)基平均分裝入2個三角瓶中。 4、做棉塞。 5、濕熱滅菌。 6、包移液管。10支/組 7、包培養(yǎng)皿。5皿/人 8、干熱滅菌。,4人一組：（按學(xué)號分組）,培養(yǎng)皿：每人包5皿。 吸管；10支/組。 干熱滅菌 99ml無菌水（玻璃珠），1瓶/組。 9ml的無菌水，8支