廈大微生物課件第七章微生物遺傳變異與育種.ppt

1、Chap.7 微生物遺傳變異和育種,微生物遺傳學(xué)研究意義 1） 微生物學(xué)的主要分支 2）為生命遺傳現(xiàn)象的解釋提供依據(jù) 3）是分子生物學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)學(xué)科 4）促進(jìn)工業(yè)微生物菌種的選育,.1 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ),一、證明遺傳物質(zhì)的三個(gè)典型實(shí)驗(yàn),-細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) -噬菌體感染實(shí)驗(yàn) -植物病毒的重建實(shí)驗(yàn),1、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) - 動(dòng)物試驗(yàn) (Grifith,1928),-細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) S（死）+R（活） S（ 少量活） +R（活） S（無細(xì)胞提取液）+R（活） S（ 少量活） +R（活）,-細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)（Avery，1944）,2噬菌體感染實(shí)驗(yàn) (Hershey;Chase,1952),3植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)

2、(Fraenkel-Conrat,1956),二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式,（一）真核與原核微生物遺傳物質(zhì)比較,原核與真核微生物基因組大小,細(xì)菌染色體數(shù)目與形狀,細(xì)菌染色體結(jié)構(gòu),真核微生物染色體結(jié)構(gòu) (示核小體）,真核生物基因結(jié)構(gòu),真核微生物基因表達(dá)控制,（二）原核生物的質(zhì)粒,質(zhì)粒： 游離于染色體外， 獨(dú)立復(fù)制，環(huán)狀、共價(jià)、 閉合dsDNA分子， 即 cccDNA。,質(zhì)粒的特點(diǎn) 1）大小： 大質(zhì)粒： 60kb、1/cell 小質(zhì)粒： 10-20/cell,2）自主復(fù)制能力：型復(fù)制、滾環(huán)復(fù)制,數(shù)量控制：嚴(yán)緊型 ；松弛型,3）轉(zhuǎn)移性：,Tra區(qū)基因：,附加體：某些質(zhì)粒既可整合進(jìn)宿主染色體，

3、又可與染色體脫離，稱之。,4）質(zhì)粒的消除： -理化因子 -原生質(zhì)體誘導(dǎo)法,5）不相容性： 兩種親緣關(guān)系相近的質(zhì)粒不能穩(wěn)定地存在于同一個(gè)細(xì)胞中。,（G-菌的部分不相容群）,質(zhì)粒的遺傳表型 1）F質(zhì)粒（致育因子） Tra基因：編碼轉(zhuǎn)移相關(guān) 蛋白；合成性纖毛,2）R質(zhì)粒（抗藥因子） -RTF基因（抗性轉(zhuǎn)移因子） -抗性決定子 （抗抗生素、抗藥、抗種金屬）,3）Col質(zhì)粒（大腸桿菌素因子） -產(chǎn)大腸桿菌素 細(xì)菌素：由細(xì)菌質(zhì)粒編碼產(chǎn)生的只能 抑制或殺滅近緣細(xì)菌或同種 不同菌株的蛋白質(zhì)。 Col質(zhì)粒類型： -非接合型：松弛型 -接合型：嚴(yán)緊型,4）Ti質(zhì)粒：合成冠癭堿、大型質(zhì)粒 5）Ri質(zhì)粒：產(chǎn)生根毛、大

4、型質(zhì)粒,7）降解質(zhì)粒：降解、接合,8）致病性質(zhì)粒： 溶血素、腸毒素（S.aureus） 9）共生固氮質(zhì)粒： -結(jié)瘤基因（nod） -固氮基因（nif） 10）隱蔽質(zhì)粒： - 未有明確表型,工程質(zhì)粒-pBR322 主要特點(diǎn)： 1）分子量小 2）穩(wěn)定、松弛型復(fù)制 3）可大量擴(kuò)增 4）容易分離 5）可攜帶小于10kb外源DNA 6）帶有2個(gè)選擇標(biāo)記 ; 7）多個(gè)單一酶切位點(diǎn) 8）容易轉(zhuǎn)化,利用選擇標(biāo)記鑒別攜帶外源片段的轉(zhuǎn)化子 (雙抗菌素對照篩選）,建議讀物,.2 基因突變和誘變育種 一、基因突變 野生型菌株：從自然界分離獲得的菌株， 稱之為。 基本培養(yǎng)基(MM)：滿足野生型菌株生長最 低營養(yǎng)要求的合

5、成培養(yǎng)基。,（一）突變類型 營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株由于突變而喪失 了 某種營養(yǎng)合成能力，而無法在基本培 養(yǎng)基上生長的變異類型。 表示： 基 因：his+，his - ； 表 型：His + ，His -,抗性突變型： 野生型菌株由于突變而產(chǎn)了對某些化學(xué)藥物或致死物理因子抗性變異類型。 表示： 基 因： strr、strs； tetr、tets； 表 型：Str r ， Str s,條件致死突變型： 某些菌株或病毒經(jīng)基因突變后，在某種條件可生長并實(shí)現(xiàn)表型，而在另一條件卻無法生長繁殖的突變類型。 (如溫度敏感突變株：Ts） 形態(tài)突變株 抗原突變株 產(chǎn)量突變株,突變株類型劃分： -選擇性突變株：營養(yǎng)

6、缺陷型、抗性 突變型、條件致死突變型 -非選擇突變株：形態(tài)、抗原、產(chǎn)量 突變型,（二）突變率及其撿出 突變率： 某一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生突變的幾率。常用單位群體中每一世代產(chǎn)生的突變株的數(shù)目來表示。,突變株的撿出及突變率的計(jì)算,撿出方法： 1）選擇性突變株 -營養(yǎng)缺陷型 -抗藥性突變 回復(fù)突變:,（三）基因突變的自發(fā)性與不對稱性 突變的自發(fā)性：基因可自發(fā)產(chǎn)生突變。 （輻射、自身有害物質(zhì)、堿基配對錯(cuò)誤） 突變的不對應(yīng)性：突變性狀與引起突變 的環(huán)境因素?zé)o直接對應(yīng)關(guān)系。,平板影印培養(yǎng)試驗(yàn) (Lederberg),（四）基因突變及其機(jī)制 1、誘發(fā)突變 (點(diǎn)突變, 畸變) 1)點(diǎn)突變 (1)堿基置換 -轉(zhuǎn)

7、換 -顛換,可能的突變型： 錯(cuò)義突變 無義突變 同義突變,相關(guān)的誘變劑 直接引起置換： 亞硝酸、亞硝基胍、羥胺、烷化劑 間接引起置換： 堿基類似物 （5BU, 5-AU),(2）移碼突變 DNA序列中插入或缺失少數(shù)核苷酸，從而使該處后面遺傳密碼的閱讀框架發(fā)生改變的突變。,2）染色體畸變 DNA分子的大段損傷，包括缺失、重復(fù)、 插入、易位（轉(zhuǎn)座）和倒拉等。,轉(zhuǎn)座：DNA分子通過非同源重組方式， 從染色體的某一部位轉(zhuǎn)移到另一部位的 現(xiàn)象。,轉(zhuǎn)座因子 凡具有轉(zhuǎn)座作用的DNA序列均稱之。 特點(diǎn)： -轉(zhuǎn)座作用 -末端重復(fù)序列 -轉(zhuǎn)座酶基因,轉(zhuǎn)座因子類型,插入序列 轉(zhuǎn)座子(或稱復(fù)合轉(zhuǎn)座子） 轉(zhuǎn)座噬菌體,a

8、）插入序列 (IS) b） 轉(zhuǎn)座子(Tn),轉(zhuǎn)座機(jī)理,轉(zhuǎn)座子的遺傳效應(yīng)和生物學(xué)意義,（復(fù)制型轉(zhuǎn)座）,遺傳效應(yīng) 1）插入突變 2）DNA重排 意義： 進(jìn)化，獲得突變株，抗藥性 鑒定必須基因,（五）紫外線對DNA的損傷及其修復(fù),1損傷的機(jī)理： 形成胸腺嘧啶二聚體 2、修復(fù)作用 1）光復(fù)活作用 光解酶-二聚體復(fù)合物為光激活,2.暗修復(fù)作用：,3、重組修復(fù) 4、SOS修復(fù),二、 突變與育種 （一）自發(fā)突變與育種(定向培育） （二）誘變育種,1、基本原則（應(yīng)考慮的問題） 1） 誘變劑的選擇 (有效性,安全性，簡便性),誘變劑誘變效果測定（回復(fù)突變率的測定） -艾姆氏試 驗(yàn)(檢測三致物質(zhì)）,2）出發(fā)菌株

9、3）誘變菌株的狀態(tài) -處理單胞（孢）懸液 -選擇單倍體或單核細(xì)胞 4）劑量：低劑量； (表示方法) 5）提高檢出效率 -利用形態(tài)特征 -鑒別培養(yǎng)基,利用鑒別培養(yǎng)基檢出突變株 -蛋白酶高活性菌株的檢出 （酪蛋白為N源，加HgCl2觀察透明圈） -淀粉酶高活性菌株的檢出 （淀粉為C源，加I2液觀察透明圈） -有機(jī)酸高產(chǎn)菌株的檢出 （培養(yǎng)基加CaCO3觀察透明圈）,6）設(shè)計(jì)高效的 篩選方案 -初篩（數(shù)量、 定性） -復(fù)篩（質(zhì)量、 定量） 7）創(chuàng)新性的 篩選方法,2、營缺型的篩選 （1）三種基本培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基- :滿足野生型菌株生長 最低營養(yǎng)要求的組合培養(yǎng)基。 完全培養(yǎng)基+ ：滿足所有營缺型菌株

10、生長營養(yǎng)要求的天然或半組合培養(yǎng)基。 補(bǔ)充培養(yǎng)基A，B ：滿足相應(yīng)營缺型 菌株生長營養(yǎng)要求的組合或半組合培養(yǎng)基。,（2）三類遺傳型個(gè)體 野生型：從自然界分離獲得的菌株不論 營養(yǎng)狀況如何，均稱為。（A+B + ） 營缺型：野生型菌株經(jīng)誘變由于代謝障礙，而必須添加某種物質(zhì)才能生長的突變株。 （A+B - ） （A-B + ） 原養(yǎng)型：營缺型回復(fù)突變后的菌株。 （A+B + ）,基本基 完全基 補(bǔ)充基 野生型 + + + 營缺型 + + 原養(yǎng)型 + + +,（3）篩選步驟 1）誘變 2）淘汰野生型：抗生素法、菌絲過濾法 3）檢出： 夾層培養(yǎng)法；限量補(bǔ)充法 逐個(gè)檢出法；影印平板法,夾層培養(yǎng)法,（4）鑒定

11、缺陷型(生長譜法) 1）制備基本 培養(yǎng)基； 2）加充分洗 滌菌懸液； 3）加待測營 養(yǎng)物； 4）觀察生長。, 定位（點(diǎn)）誘變,盒式誘變 寡核苷酸引物誘變,Strain improvement for fermentation and biocatalysis processes by genetic engineering technology,建議讀物,.3 基因重組 基因重組（遺傳重組）： 兩個(gè)獨(dú)立基因組內(nèi)的遺傳物 質(zhì)，通過一定的途徑轉(zhuǎn)移到一 起，形成新的穩(wěn)定的基因組過程。,遺傳工程 -基因重組技術(shù) 經(jīng)典、同源、生物自然屬性、 體內(nèi) -DNA重組技術(shù)： 分子水平、同- 異源、體外,一、原核

12、生物的基因重組 （一）轉(zhuǎn)化 受體菌直接吸收供體菌游離的 DNA片段而獲得部分遺傳性狀的現(xiàn) 象。,1、轉(zhuǎn)化的基本條件 （1）感受態(tài)： 受體菌最容易接受外源DNA 片段并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。 影響因素： -遺傳因素（感受態(tài)因子;種屬的特異性；） -外部因素（CAMP、聚乙二醇、二價(jià)陽 離子-低溫低滲CaCl處理、培養(yǎng)條件）,轉(zhuǎn)化頻率：0.11%（很低），最高10%，質(zhì)粒 為良好的轉(zhuǎn)化因子。 濃度：10-5 ug/ml,結(jié)構(gòu)：一般轉(zhuǎn)化因子都是線狀雙鏈DNA，少數(shù)為 線狀單鏈DNA。,大?。好恳晦D(zhuǎn)化DNA片段分子量約 1107， 約占 染色體組0.3%，平均 15個(gè)基因。,（2）轉(zhuǎn)化因子,轉(zhuǎn)化因

13、子,非交換,2、轉(zhuǎn)化過程 1）酶解和吸收單鏈 2）同源區(qū)配對、 整合 3）復(fù) 制 4）形成轉(zhuǎn)化子,3.轉(zhuǎn)染(Tranfection) 提純的病毒DNA或RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞并增殖出正常的病毒后代現(xiàn)象。 If DNA from a virus is used as the cloning vector, the process is called transfection. (Introduction to microbiology, John L. Ingraham ),（二）轉(zhuǎn)導(dǎo) 完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介,使受體細(xì)胞獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。,1、普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 完全缺陷噬菌體對供體任何

14、DNA小片 段進(jìn)行“誤包”,而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，包括完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)和流產(chǎn) 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種類型。,完全轉(zhuǎn)導(dǎo) (形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子),感染復(fù)數(shù)：感染的噬菌體數(shù)/被感染細(xì)胞數(shù),流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)：(僅形成一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)子, 產(chǎn)生小菌落),經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入受體菌的供體菌DNA片段，在受體菌內(nèi)不交換、整合、復(fù)制，也不迅速消失，僅進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯、性狀表達(dá)轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。,、局限轉(zhuǎn)導(dǎo) 部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌少數(shù)特定的基因攜帶到受體菌中并獲得表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。,A、低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（） ）噬菌體感染 ）誘導(dǎo)裂解 ）不正常切離（低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物）（ dgal、 dbio） ）形成局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子,B、高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（） 1）概念 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)(LFT)裂解物

15、：溶源噬菌體感染后， 帶少數(shù)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的細(xì)胞裂解物。 雙重溶源菌：同時(shí)感染有正常噬菌體 和缺陷噬菌體的受體菌。 (來源：LFT裂解物以高的感染復(fù)數(shù)感染宿主),雙重溶源菌,2）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：在局限轉(zhuǎn)導(dǎo)中，用雙重溶源 菌誘導(dǎo)后產(chǎn)生的高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌 可獲得的高達(dá) 50% 的轉(zhuǎn)導(dǎo)子，稱之。 3）過程： 1）雙重溶源菌 2）誘導(dǎo)，獲得高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物 3）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物低m.o.i感染受體菌,（3）溶源轉(zhuǎn)變,溫和噬菌體 感染宿主后，宿主通過 溶源化而獲得免疫性以外新性狀的現(xiàn) 象。 白喉毒素： 白喉?xiàng)U菌的-噬菌體帶有“TOX”基因,（三）接合 接合：通過細(xì)胞間的直接接觸,由質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的

16、現(xiàn)象. 接合子：通過接合 而獲得新的遺傳 性狀的受體細(xì)胞。, 存在方式:四種接合型菌株 1、F -,2、 F+ 菌株,Orit：起始子,3、Hfr菌株：高頻重組菌株， F+整合在染色體上 成為附加體的狀態(tài)，若與F -接合，有很高的重組 頻率。 1）細(xì)胞接觸 2）Hfr斷裂、 轉(zhuǎn)移、 復(fù)制 3）接合中斷 4）形成接合子,利用接合中斷法繪制染色體圖譜,中斷雜交試驗(yàn),基因測序 （鳥槍法） 1.構(gòu)建文庫 2.隨機(jī)測序 3.片斷排列 4.編輯,4、 F 菌株 （質(zhì)粒帶有部分染色體片斷的菌株） 初生F 菌株 次生F 菌株,建議讀物,基因水平轉(zhuǎn)移是細(xì)菌進(jìn)化的主要?jiǎng)恿?微生物功能基因組學(xué),（四）原生質(zhì)體融合,通過人為方法,使遺傳性狀不同的兩個(gè) 細(xì)胞的原生質(zhì)體融合,繼而遺傳重組,借 以獲得兼有雙親性狀,遺傳性穩(wěn)定的融 合子的過程。,主要步驟： 1）選擇親本 2）制備原生質(zhì)體 3）促融 4）原生質(zhì)體再生 5）融合子檢出 6）篩選,Metabolic engineering by genome shulffling G.Steph