第14章 色譜分析法導(dǎo)論.ppt

1、第14章色譜分析簡(jiǎn)介，色譜指南，第四章，14-1-1色譜，是分離和分析混合物的最有效方法。將待分析樣品的每種成分逐一分離，然后依次檢測(cè)每種成分的含量。14-1色譜方法概述，茨維特(18721919)成立于1906年。俄羅斯植物生理學(xué)家和化學(xué)家。茨維特應(yīng)用化學(xué)方法研究細(xì)胞生理學(xué)。1900年，他在葉子中發(fā)現(xiàn)了兩種葉綠素：葉綠素a和葉綠素b，后來發(fā)現(xiàn)了葉綠素c并分離出純?nèi)~綠素。他最大的貢獻(xiàn)是色譜的發(fā)明，色譜是分析化學(xué)和有機(jī)化學(xué)中一種重要的實(shí)驗(yàn)方法。他關(guān)于色譜的第一篇論文發(fā)表在1903年的華沙生物學(xué)雜志上。從1906年到1910年的所有論文都發(fā)表在德國(guó)植物學(xué)雜志上。在這些論文中，他詳細(xì)描述了用自己的色

2、譜分析儀分離胡蘿卜素、葉綠素和葉黃素。因?yàn)樗恼撐陌l(fā)表在一個(gè)鮮為人知的雜志上，所以當(dāng)時(shí)沒有引起化學(xué)界的注意。直到1931年，庫(kù)恩才發(fā)現(xiàn)茨維特發(fā)明的色譜法的重要性，這種方法得到了廣泛的推廣和應(yīng)用。色譜是一種分離技術(shù)；裝有碳酸鈣的玻璃柱叫做色譜柱。其中一個(gè)相位是固定的，這被稱為固定相位。另一相是攜帶樣品混合物通過固定相的流體(氣體或液體)，稱為流動(dòng)相。樣品混合物的分離過程是樣品中各組分在色譜柱中兩相之間的連續(xù)分布過程。色譜的本質(zhì)是分離，它是基于在不混溶的兩相固定相和流動(dòng)相中的混合物組分之間的吸附容量、分配系數(shù)或其它親和性能的差異。當(dāng)混合物的每一種組分隨流動(dòng)相一起通過固定相時(shí)，它在流動(dòng)相和固定相之間

3、重復(fù)分布，因此吸附性能或分布系數(shù)略有不同的物質(zhì)在移動(dòng)速度上會(huì)有很大差異，從而被分離。結(jié)合適當(dāng)?shù)闹髾z測(cè)方法，可以實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離和檢測(cè)。在色譜發(fā)展史上占有重要地位的英國(guó)人馬丁和辛格提出了色譜盤理論；發(fā)明了液-液分配色譜法；據(jù)預(yù)測(cè)，氣體可以用作流動(dòng)相(即氣相色譜)。1952年，他們因?qū)Ψ峙渖V理論的貢獻(xiàn)獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。色譜的發(fā)展歷史，諾貝爾獎(jiǎng)的研究工作，色譜發(fā)揮了關(guān)鍵作用，14-1-2色譜分類，1。根據(jù)流動(dòng)相和固定相的物理狀態(tài)進(jìn)行分類，流動(dòng)相、氣相、液相、超臨界流體、氣相色譜、液相色譜、超臨界流體色譜、氣-固相色譜。固體吸附劑，吸附，液體，分配，液-固色譜(LSC)，液-液色譜(有限

4、責(zé)任公司)，固體吸附劑，吸附，液體，分配，超臨界流體色譜，2。按固定相分類，柱內(nèi)固定相色譜，柱色譜，板色譜，板狀固定相色譜，紙色譜3。根據(jù)分離過程的機(jī)理，吸附色譜法：利用不同組分在吸附劑表面的物理吸附性能差異，分配色譜法：利用不同組分在兩相中的不同分布系數(shù)，離子交換色譜法：利用離子交換原理，排阻色譜法：利用多孔物質(zhì)對(duì)不同大小分子的排阻作用，以及14-1-3色譜法的特點(diǎn)和分類；(1)分離效率高，混合物復(fù)雜，有機(jī)同系物和異構(gòu)體多。手性異構(gòu)體。(2)靈敏度高，可檢測(cè)10-1110-13 g物質(zhì)。(3)分析速度快，樣品分析可在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)完成。(4)應(yīng)用范圍廣，氣相色譜：分析沸點(diǎn)低于400的各種

5、有機(jī)或無機(jī)樣品。液相色譜：分離和分析具有高沸點(diǎn)和熱不穩(wěn)定性的生物樣品。蛋白質(zhì)含有碳、氫、氧、氮、硫和其他元素。其中，倪因此，丹麥化學(xué)家約翰凱達(dá)巧妙地認(rèn)為，既然氮含量是穩(wěn)定的，只要準(zhǔn)確地測(cè)量氮含量，就可以計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。這種方法發(fā)表于1883年，無疑對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)做出了巨大貢獻(xiàn)。然而，凱氏定氮法也有一些缺點(diǎn)。最大的問題是，這種方法只能檢測(cè)氮含量，但不能鑒定蛋白質(zhì)的真實(shí)性。不難想象，只要加入高氮含量的物質(zhì)，凱氏定氮法就能被愚弄，就能輕易獲得“高蛋白含量”的稱號(hào)。以三聚氰胺為例，其分子式由3個(gè)碳原子、6個(gè)氫原子和6個(gè)氮原子組成，氮含量高達(dá)66.7。然而，牛奶的蛋白質(zhì)氮含量只有15.7，大豆只有16。

6、毫無疑問，三聚氰胺在氮含量比較中勝出。難怪有人稱三聚氰胺為“蛋白質(zhì)精華”。三聚氰胺具有輕微的生物毒性。早在1945年，美國(guó)紐約Ridler實(shí)驗(yàn)室的兩位毒理學(xué)家就發(fā)表了一篇論文，指出長(zhǎng)期給老鼠、兔子和狗喂食大劑量的三聚氰胺會(huì)對(duì)它們的生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)以及膀胱和腎結(jié)石造成損害，并進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定三聚氰胺的檢測(cè)方法為高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜，檢測(cè)定量限分別為2毫克/千克、0.05毫克/千克和0.01毫克/千克。本標(biāo)準(zhǔn)適用于原料乳、乳制品和乳制品中三聚氰胺的定量測(cè)定。缺點(diǎn)：很難對(duì)分離的成分進(jìn)行表征。13-1-3色譜的特點(diǎn)和分類，(1)分離效率高，混合物復(fù)雜，有機(jī)同系物

7、和異構(gòu)體多。手性異構(gòu)體。(2)靈敏度高，可檢測(cè)10-1110-13 g物質(zhì)。(3)分析速度快，樣品分析可在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)完成。(4)應(yīng)用范圍廣，氣相色譜：分析沸點(diǎn)低于400的各種有機(jī)或無機(jī)樣品。液相色譜：分離和分析具有高沸點(diǎn)和熱不穩(wěn)定性的生物樣品。島津氣相色譜儀，Clarus 500美國(guó)PE氣相色譜儀，大連氣相色譜儀，南京高效液相色譜，14-2色譜分離原理，14-2-1色譜分離過程，液-液色譜，對(duì)于混合樣品，為了完全分離所有組分，必須滿足三點(diǎn)：兩個(gè)組件的遷移率必須不同；2.區(qū)域加寬的速率小于區(qū)域分離的速率；(面積擴(kuò)大：成分沿柱的擴(kuò)散分布)3。在確保快速分離的前提下，提供足夠長(zhǎng)的色譜柱。當(dāng)沒

8、有樣品通過檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)到的信號(hào)即為基線。14-2-2色譜圖。樣品的每種成分被色譜柱分離后，從色譜柱后面流出，進(jìn)入檢測(cè)器。檢測(cè)器將每種成分的濃度(或質(zhì)量)變化轉(zhuǎn)換成電壓(或電流)信號(hào)，然后由記錄儀記錄下來。電信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線稱為流出曲線，即色譜圖。1?；€，2。峰高，色譜峰頂?shù)交€的距離，h，一個(gè)用于測(cè)量色譜峰寬的參數(shù)，可以用三種方式表示：(1)峰底寬度(Wb):在色譜峰和基線兩側(cè)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)上畫出的切線之間的相交截距；拐點(diǎn)位于0.607小時(shí)(2)半峰寬(W1/2):色譜峰高一半處的寬度；(3)標(biāo)準(zhǔn)偏差():拐點(diǎn)之間距離的一半，即色譜峰寬度的一半，為峰高的0.607倍。3。面積寬度，Wb=

9、4，W1/2=2.354。練習(xí)：眾所周知，半峰寬是4.708毫米，所以找出峰底的寬度。4。峰面積A，峰和基線延長(zhǎng)線所覆蓋的面積，A=1.065hW1/2，14-2-3保留值，1。保留值用時(shí)間表示，(2)保留時(shí)間(tR)，從開始注射到色譜峰最大值所需的時(shí)間；組件的保留時(shí)間是指組件通過色譜柱所需的時(shí)間，即組件在色譜柱中運(yùn)行的時(shí)間。(1)停滯時(shí)間(tM)，即從進(jìn)樣到達(dá)到最大峰值，固定相未保留的組分所需的時(shí)間。實(shí)際上，這是流動(dòng)相流動(dòng)所需的時(shí)間實(shí)際上，它是組分被固定相保留的總時(shí)間，反映了組分和固定相之間的相互作用。(2)保留體積，即從進(jìn)樣開始到色譜峰最大值的流動(dòng)相體積。(1)死體積(VM)，固定相未保留

10、的組分，從注射到峰最大消耗的流動(dòng)相體積。(3)調(diào)整保留體積，即保留體積和死體積之間的差值，即當(dāng)組分停留在固定相時(shí)消耗的流動(dòng)相體積。各種保留時(shí)間受流動(dòng)相流速的影響，各種保留體積與流動(dòng)相流速無關(guān)。2。保留值用體積表示，tR=tRtM，傳統(tǒng)上，tR2為tR1，所以1表示色譜圖中兩個(gè)峰的相對(duì)位置。相對(duì)保留值僅與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)。它表明了固定相對(duì)這兩種組分的選擇性。3。相對(duì)保留值(選擇性因子，ri，s或)，組分2與組分1的調(diào)整保留值之比：1。參比組分可以是被測(cè)物質(zhì)中的特定組分，也可以人工制備；2.組分的色譜分離是基于兩相之間平衡分布的差異。均衡分配可以用分配系數(shù)和容量因子來表

11、征。14-2-4分配系數(shù)和容量因子，組分在固定相和流動(dòng)相中的吸附、解吸或溶解和揮發(fā)的過程稱為分配過程。在一定溫度下，兩相分布達(dá)到平衡時(shí)各組分的濃度比(單位：g/mL)稱為分布系數(shù)，用k表示，即k不僅與溫度和壓力有關(guān)，還與組分、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)有關(guān)。分配系數(shù)是色譜分離的基礎(chǔ)。不同組分分配系數(shù)的差異是色譜分離的前提。分配系數(shù)的差異越大，越容易實(shí)現(xiàn)分離。1。分因子)K，例如：某氣液色譜柱上組分a和組分b的K分別為495，467，哪個(gè)峰先出現(xiàn)？2。在實(shí)際工作中，分配比經(jīng)常被用來表征色譜分配平衡過程。分配比是指組分在一定溫度下平衡分布在兩相之間時(shí)的質(zhì)量比：1。分配系數(shù)和分配比是與組分和固定相的熱力學(xué)

12、性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，并隨分離柱溫度和柱壓的變化而變化。2.分配系數(shù)和分配比都是衡量色譜柱保留容量的參數(shù)。該值越大，組分的保留時(shí)間越長(zhǎng)。3.分配比可以通過實(shí)驗(yàn)來測(cè)量。容量因子也稱為：容量因子和分區(qū)無線電；3.容量因子和分配系數(shù)之間的關(guān)系，在這種關(guān)系中使用比較。填充柱比：535；毛細(xì)管柱的比例：50200。容量因子越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。Vm是流動(dòng)相體積，即柱中固定相顆粒之間的空隙體積；VS是固定相的體積；4。分配系數(shù)k與保留值之間的關(guān)系，當(dāng)一個(gè)組分的色譜峰的最高點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)，意味著正好一半的組分在VR體積的流動(dòng)相中洗脫并流出柱，而另一半保留在柱中，即在柱中的流動(dòng)相(體積Vm)和固定相(體積Vs)中。根據(jù)物質(zhì)

13、平衡原理，得到了cm、VM、VM、VM、Vm色譜過程的基本方程，反映色譜行為的保留值與反映物質(zhì)性質(zhì)的熱力學(xué)常數(shù)k有關(guān)。5。容量因子與保留值之間的關(guān)系，上述公式也可以寫成、注，6。分布系數(shù)K和容量因子K與選擇性因子之間的關(guān)系，從色譜流出曲線，信息是：(1)根據(jù)色譜峰的數(shù)目，可以判斷樣品中組分的最小數(shù)目(2)根據(jù)色譜峰的保留值(3)。，為什么組分的保留時(shí)間不同？為什么色譜峰變寬了？組分保留時(shí)間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制；(組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì))色譜峰的展寬：色譜過程中動(dòng)力學(xué)因素的控制；(兩相運(yùn)動(dòng)阻力，擴(kuò)散)，兩種色譜理論：塔板理論和速率理論；14-3-1塔板理論)-柱分離效率指數(shù)，半經(jīng)驗(yàn)理論；

14、將色譜柱與蒸餾塔相比較，假設(shè)連續(xù)色譜柱由許多小段組成。在每個(gè)片段中，一部分空間被固定相占據(jù)，另一部分被流動(dòng)相占據(jù)。組分隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱后，它們分布在兩相之間。托盤理論的假設(shè)：(1)在每一小段中，均衡可以很快實(shí)現(xiàn)；(2)載氣被視為脈動(dòng)(間歇)過程；(3)樣品沿色譜柱方向的擴(kuò)散可以忽略不計(jì)；(4)每次分配的分配系數(shù)相同。理論塔板高度h:理論塔板數(shù)n:色譜柱長(zhǎng)度：那么三者之間的關(guān)系是：這樣組分可以達(dá)到平衡分布在柱中兩相之間所需的柱長(zhǎng)；流過色譜柱時(shí)，組分在兩相之間均勻分布的次數(shù)；L；根據(jù)塔板理論，當(dāng)柱中溶質(zhì)的平衡數(shù)為n50時(shí)，可以得到基本對(duì)稱的峰曲線。樣品進(jìn)入色譜柱后，只要兩相之間的分配系數(shù)略有差異

15、，重復(fù)分配平衡后就可以得到良好的分離。由塔板理論推導(dǎo)出的理論塔板數(shù)n的計(jì)算公式為：扣除死時(shí)間后，以有效理論塔板數(shù)作為柱效指數(shù)：注：同一色譜柱的柱效因物質(zhì)不同而不同。因此，在解釋色譜柱效率時(shí)，不僅應(yīng)指出色譜條件，還應(yīng)指出用于測(cè)量的物質(zhì)。同樣，當(dāng)比較不同色譜柱的柱效時(shí)，我們必須確定操作條件，使用相同的物質(zhì)通過不同的色譜柱，并從色譜峰計(jì)算出n的有效值和柱效。示例：已知1米長(zhǎng)色譜柱的氮效率為1600，該色譜柱上組分A的調(diào)整保留時(shí)間為100秒，因此請(qǐng)嘗試找出峰A的半寬和有效塔板高度。用色譜法分離A和B的混合物，B的半峰寬為9毫米，保留時(shí)間調(diào)整為3分鐘2秒，記錄儀的送紙速度為3000毫米/小時(shí)，該色譜柱的有效理論塔板數(shù)是多少？解決方案：例如，在2m長(zhǎng)的色譜柱上，某一組分的保留時(shí)間為6.6分鐘，峰底寬度為0.5分鐘，停滯時(shí)間為1.2分鐘，載氣體積流量為40毫升分鐘-1，固定相體積為2.1毫升(1)分配比k；(2)死體積虛擬機(jī)；(3)調(diào)整預(yù)留音量VR；(4)分布系數(shù)k；(5)有效塔板數(shù)；(6)有效塔板高度(流動(dòng)相體積為死體積)。例如，在2m長(zhǎng)的色譜柱上，某一組分的保留時(shí)間為6.6分鐘，峰底寬度為0.5分鐘，停滯時(shí)間為1.2分鐘，載氣體積流量為40