課題2　土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù) (5)

1、課題2: 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù),1、尿素,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細(xì)菌利用尿素的原因,土壤中的細(xì)菌分解尿素是因為它們能合成脲酶,誘思導(dǎo)學(xué),3、本節(jié)目的,從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌,統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣 的細(xì)菌,一.研究思路,.篩選菌株,.統(tǒng)計菌落數(shù)目,.設(shè)置對照,1、實例：,尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。（自然環(huán)境中篩選菌株）,熱泉溫度70800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來。,.篩選菌株,2、實驗室中微生物的篩選：,人為提供有利于目

2、的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。,什么是選擇性培養(yǎng)基？P22,3、選擇培養(yǎng)基的常見類型 (1)分離微生物所用的選擇培養(yǎng)基一定是固體培養(yǎng)基，因為菌落只能在固體培養(yǎng)基上形成。 (2)常見的選擇培養(yǎng)基 加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌。 加入高濃度的食鹽可得到金黃色葡萄球菌。 無氮源培養(yǎng)基可以分離固氮微生物。 以石油為唯一碳源的培養(yǎng)基，可以分離能消除石油污染的微生物。 將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)，可以分離耐高溫的微生物。,自主學(xué)習(xí),4、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？,固體培養(yǎng)基,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,

3、碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。,5、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理,6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？,以尿素為 唯一氮源 的培養(yǎng)基,牛肉膏 蛋白胨 培養(yǎng)基,是,分離 尿素 細(xì)菌,判斷該 培養(yǎng)基 有無選 擇性,只生長尿素細(xì)菌,生長多種微生物,是,1、顯微鏡直接計數(shù)：,利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,.統(tǒng)計菌落數(shù)目（直接計數(shù)和間接計數(shù)）,不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運(yùn)動細(xì)菌

4、的計數(shù)； 需要相對高的細(xì)菌濃度； 個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,缺點(diǎn),2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法） 原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細(xì)胞。 常用方法：稀釋涂布平板法。,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,注意事項： 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計數(shù)。 為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。,合作

5、探究,設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。,.設(shè)置對照：,實例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計菌 落數(shù)目的實驗時，A同學(xué)從對應(yīng)的106 倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌 落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下 只選擇出大約50個菌落。分析其原因。,原因：土樣不同， 培養(yǎng)基污染或操作失誤 (或者是混入了其他的含氮物質(zhì)),小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。,方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實驗,方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果

6、與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,二.實驗的具體操作 .土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。 .制備培養(yǎng)基： 制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。,*應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。 *在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,三樣品的稀釋,.取樣涂布,*實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,.取樣涂布,分離不同的微生物采用不同的稀釋度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,.微生物的培養(yǎng)與觀察,在

7、菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。,微生物的培養(yǎng)與觀察,三.結(jié)果分析與評價 1.通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。 2.提示：選擇每個平板上長有30300個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。,四.操作提示 (1)無菌操作 取土樣的用具在使用前都需要 。 實驗操作均應(yīng)在 進(jìn)行。 (2)做好標(biāo)記：本實驗使用的平板和試管比較多，為避免混淆，使用前應(yīng)標(biāo)明培養(yǎng)基的 、 、 以及平板上培養(yǎng)樣品的 等。 (3)制定計劃：對于耗時較長的生物實驗，要事先制定計劃，以便提高_(dá)。,滅菌,火焰旁,種類,培養(yǎng)日期,稀釋度,工作效率,達(dá)標(biāo)測評,五.課外延伸 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基