儀器分析色譜導(dǎo)論

1、第四章 色譜分析法導(dǎo)論,4.1 概述 4.2 色譜流出曲線 4.3 色譜法基本原理 4.4 色譜定性和定量分析,Chromatography,1906年，俄國植物學(xué)家茨維特在分離植物葉子中的色素時(shí)，將葉片的石油醚（飽和烴混合物）提取液倒入一根裝有CaCO3粉末的豎直玻璃管中，再加入純的石油醚任其自然流下，一會兒柱中出現(xiàn)不同顏色的譜帶，植物浸取液中的色素得到了分離。,4-1 概述,色譜法的產(chǎn)生,色譜法中包含兩相 固定相固定不動的相 CaCO3 流動相推動混合物流動的液體 石油醚,色譜法：一種重要的分離分析方法，混合物在流動相的攜帶下通過色譜柱分離出幾種組分的方法。,1、按兩相狀態(tài)分類,2、按操作

2、形式分類 （1）柱色譜：固定相裝在柱管內(nèi)的色譜法。 （2）紙色譜：濾紙為固定相的色譜法，流動相是含一定比例水的有機(jī)溶劑，樣品在濾紙上展開進(jìn)行分離。 （3）薄層色譜：把固體固定相壓成或涂成薄膜的色譜法。,3、按分離原理分類 （1）吸附色譜：利用吸附劑表面對被分離的各組分吸附能力不同進(jìn)行分離。 （2）分配色譜：利用固定液對各組分的溶解能力不同進(jìn)行分離。 （3）離子交換色譜：利用離子交換劑對各組分的親和力不同進(jìn)行分離。 （4）凝膠色譜：利用凝膠對分子的大小和形狀不同的組分所產(chǎn)生的阻礙作用不同而進(jìn)行分離的色譜法。,4-2 色譜圖及色譜常用術(shù)語,一、色譜圖,1、基線在實(shí)驗(yàn)操作條件下，色譜柱后沒有樣品組分

3、流出的曲線稱為基線。穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。 2、峰高色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以（h）表示。峰高低與組分濃度有關(guān)，峰越高越窄越好。,二、色譜圖中的基本術(shù)語,標(biāo)準(zhǔn)偏差峰高0.607倍處的色譜峰寬的一半。 半峰寬Y1/2峰高一半處對應(yīng)的峰寬。 Y1/2 =2.354 基線寬度Y色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)所作切線在基線上的距離。 Y =4 4、色譜峰面積A色譜峰與峰底所圍的面積。,3、色譜峰的寬度,（1）死時(shí)間t0不被固定相吸附或溶解的組分流經(jīng)色譜柱所需的時(shí)間。 （2）保留時(shí)間tR組分流經(jīng)色譜柱時(shí)所需時(shí)間。 （3）調(diào)整保留時(shí)間tR扣除了死時(shí)間的保留時(shí)間。 tR =tR-t0 *tR體現(xiàn)的是組分在柱

4、中被吸附或溶解的時(shí)間，更合理的反映了被測組分的保留特性。,5、色譜保留值定性的依據(jù),（5）死體積V0指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當(dāng)后兩相很小可忽略不計(jì)時(shí)，死體積就是色譜柱中的所有空隙的總體積。死體積與死時(shí)間關(guān)系： V0 = t0F0 式中，F(xiàn)0為柱后出口處流動相的體積流速。,（6）保留體積VR指從進(jìn)樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所通過的流動相體積。 VR= tRF0 （7）調(diào)整保留體積VR扣除了死體積的保留體積。 VR=VRV0=tRF0 （8）相對保留值在相同操作條件下，組分2對另一參比組分1調(diào)整保留值之比。,

5、色譜流出曲線的意義：,色譜峰數(shù)=樣品中單組份的最少個(gè)數(shù)； 色譜保留值定性依據(jù)； 色譜峰高或面積定量依據(jù)； 色譜保留值或區(qū)域?qū)挾壬V柱分離效能評價(jià)指標(biāo)； 色譜峰間距固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)。,三、分配平衡 在一定溫度和壓力下，組分在流動相和固定相之間所達(dá)到的平衡叫分配平衡。組分在兩相中的分配行為常采用分配系數(shù)K和分配比 來表示。,分配比也是由組分、固定相和流動相的熱力學(xué)性質(zhì)決定的。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動相及固定相的體積有關(guān)。 分配比越大，說明組分在固定相中的量越多，相當(dāng)于柱的容量大，因此又稱容量比或容量因子。它是衡量色譜柱對被分離組分保留能力的重要參數(shù)。,分配系數(shù)是由

6、組分、固定相和流動相的熱力學(xué)性質(zhì)決定的，它是一定色譜條件下每種溶質(zhì)的特征值。它僅與柱溫、柱壓有關(guān)，而與兩相體積、柱管的特性以及所使用的儀器無關(guān)。不同組分分配系數(shù)的差異是實(shí)現(xiàn)色譜分離的先決條件。,4-3 色譜法的基本理論,色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。 但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過程的動力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學(xué)和動力學(xué)兩方面來研究色譜行為。,在50年代，色譜

7、技術(shù)發(fā)展的初期，Martin等人把色譜分離過程比作分餾過程，并把分餾中的半經(jīng)驗(yàn)理論塔板理論用于色譜分析法。 塔板理論把色譜柱比作一個(gè)分餾塔，塔內(nèi)有若干個(gè)想象的塔板，物質(zhì)在每個(gè)塔板里的兩相之間達(dá)到一次分配平衡。經(jīng)過多次這樣的分配之后，最后，揮發(fā)度大的組分和揮發(fā)度小的組分彼此分離，揮發(fā)度大的最先從塔頂（即柱后）逸出。顯然這個(gè)理論并不完全符合色譜柱的實(shí)際分離過程，色譜分離和一般的分餾塔分離有著重大的差別，但是因?yàn)檫@個(gè)比喻形象簡明，能說明一些問題，因此幾十年來一直沿用。,塔板理論柱分離效能指標(biāo),塔板理論的假設(shè)： 在每一個(gè)平衡過程間隔內(nèi)，平衡可以迅速達(dá)到； 將載氣看作成脈動（間歇）過程； 試樣沿色譜柱方

8、向的擴(kuò)散可忽略； 每次分配的分配系數(shù)相同。,塔板理論是一種半經(jīng)驗(yàn)性理論。它用熱力學(xué)的觀點(diǎn)定量說明了溶質(zhì)在色譜柱中移動的速率，解釋了流出曲線的形狀，并提出了計(jì)算和評價(jià)柱效高低的參數(shù),有一定的開創(chuàng)性。但是，色譜過程不僅受熱力學(xué)因素的影響，還與分子的擴(kuò)散、傳質(zhì)等動力學(xué)因素有關(guān)，塔板理論只能定性地給出板高的概念，卻不能解釋板高受哪些因素影響；也不能說明為什么在不同的流速下，可以測得不同的理論塔板數(shù)，因而限制了它的應(yīng)用。,1956年荷蘭學(xué)者van Deemter（范第姆特）等在研究氣液色譜時(shí)，提出了色譜過程動力學(xué)理論速率理論。他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過程，從而

9、在動力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。van Deemter方程的數(shù)學(xué)簡化式為 H = A + B/u + Cu 式中u為流動相的線速度(線速度=柱長/死時(shí)間)；A、B、C為常數(shù)，分別代表渦流擴(kuò)散系數(shù)、分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)、傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)。,速率理論影響柱效的因素,1、渦流擴(kuò)散項(xiàng)A：在填充柱中，由于受到固定相顆粒的阻礙，組份在遷移過程中隨流動相不斷改變方向，形成紊亂的“渦流”：從圖中可見，因填充物顆粒大小及填充的不均勻性同一組分運(yùn)行路線長短不同流出時(shí)間不同峰形展寬。 A2dp A與填充物的平均直徑dp的大小和填充不均勻因子有關(guān)。,2、分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u（縱向擴(kuò)散項(xiàng)）：縱向分子擴(kuò)散是由于濃度梯度

10、引起的。當(dāng)樣品被注入色譜柱時(shí)，它呈“塞子”狀分布。隨著流動相的推進(jìn)， “塞子”因濃度梯度而向前后自發(fā)地?cái)U(kuò)散，使譜峰展寬。 B2D 是填充柱內(nèi)流動相擴(kuò)散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了固定相的幾何形狀對分子擴(kuò)散的阻礙情況。 D為組分在流動相中擴(kuò)散系數(shù)（c m2s-1）。 Dg氣相擴(kuò)散系數(shù)比液相擴(kuò)散系數(shù)Dm大的多（約105倍）,3、傳質(zhì)阻力項(xiàng)Cu：由于濃度不均勻而發(fā)生物質(zhì)遷移過程稱為傳質(zhì)，影響該過程進(jìn)行速度的阻力為傳質(zhì)阻力。傳質(zhì)阻力系數(shù)包括兩部分，即m+Cs兩項(xiàng)組成。 Cm流動相傳質(zhì)阻力系數(shù)，組分從流動相移動到固定相表面進(jìn)行兩相之間的質(zhì)量交換時(shí)所受到的阻力，質(zhì)量交換慢，引起色譜峰變寬。 Cs

11、固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)，即組分從兩相界面移動到固定相內(nèi)部，達(dá)分配平衡后，又返回到兩相界面，在這過程中所受到的阻力為固定相傳質(zhì)阻力。,氣相色譜,液相色譜,GC（a）u有一最低點(diǎn)u最佳；u小或u大，H都大； LC（b）u沒有最低點(diǎn)； u大，H增大不多，因此可用較高的流速，提高分析速度。,分離度總分離效能指標(biāo),分離度(分辨率、分辨度)是一個(gè)綜合性指標(biāo),既能反映柱效能又能反映選擇性的指標(biāo)，稱總分離效能指標(biāo)。它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即,分離度與柱效能、選擇性的關(guān)系,a：柱效項(xiàng)：通過增加柱長提高分離度。然而，分析時(shí)間也相應(yīng)增加，且峰寬也展寬！為提高柱效，用減小塔板高

12、度H的方法比增加柱長更有效。,c：柱容量項(xiàng)： 一般2 。對于GC，通過提高溫度，以改進(jìn)分離度；對于LC，改變流動相的組成，以改進(jìn)分離度，它對LC的分離能起到立竿見影的效果。,b：選擇性項(xiàng)：增大 是提高分離度的最有效方法，增大 的最有效方法是選擇合適的固定液。,以n有效表示，則有：,4-4 色譜定性和定量分析,在了解樣品的來源、性質(zhì)、分析目的的基礎(chǔ)上，對樣品組成作初步的判斷，再利用保留值確定各色譜峰所代表的化合物； 色譜法與其它儀器分析方法聯(lián)用（如：GC-MS)目前解決復(fù)雜混合物中未知物定性的最有效工具。,一、定性分析確定每個(gè)色譜峰所代表的化合物,不同物質(zhì)在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保

13、留值，即保留值并非專屬的；,2.相對保留值法：相對保留值r21僅與柱溫和固定液性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊中都列有各種物質(zhì)在不同固定液上的保留數(shù)據(jù)，可以用來進(jìn)行定性鑒定。 3.保留指數(shù)定性法：保留指數(shù)又稱為柯瓦（Kovts）指數(shù)，它表示物質(zhì)在固定液上的保留行為，是目前使用最廣泛并被國際上公認(rèn)的定性指標(biāo)。它具有重現(xiàn)性好、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一及溫度系數(shù)小等優(yōu)點(diǎn)。 4.與其它分析儀器聯(lián)用的定性方法（如：GC-MS等),1.利用保留時(shí)間定性：此方法要求操作條件穩(wěn)定、一致，必須嚴(yán)格控制操作條件，尤其是流速。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對比。,二、定量分析,氣相色譜定量分析是根據(jù)檢測器對溶質(zhì)產(chǎn)生的響應(yīng)信號與溶質(zhì)的量成正

14、比的原理，通過色譜圖上的峰面積或峰高，計(jì)算樣品中溶質(zhì)的含量。,mi被測組分i的質(zhì)量，fi比例系數(shù)，定量校正因子 Ai、hi被測組分的峰面積及峰高,峰面積的測量 對于對稱的色譜峰 A=1.065hY1/2 對于非對稱的色譜峰 A=h(Y0.15+Y0.85)/2,定量校正因子 絕對校正因子 相對校正因子,定量方法,歸一化法：所有出峰組分的含量之和按100%計(jì)。,外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）:,對內(nèi)標(biāo)物的要求： 內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是樣品中不存在的純物質(zhì)； 內(nèi)標(biāo)物的峰位置應(yīng)盡量靠近被測組分的峰，或位于幾個(gè)被測物色譜峰的中間并與這些色譜峰完全分離； 內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量應(yīng)與被測物質(zhì)的質(zhì)量接近，能保持色譜峰大小差不多。,例題1：

15、,已知物質(zhì)A和B在一根30.00 cm長的柱上的保留時(shí)間分別為16.40 min和17.63 min。不被保留組分通過該柱的時(shí)間為1.30 min。峰底寬度分別為1.11 min和1.21 min，計(jì)算： （1）柱的分離度； （2）柱的平均塔板數(shù)；,柱的平均塔板數(shù)：n = 16 (16.40 /1.11)2 = 3493 n = 16 (17.63 /1.21)2 = 3397 n平均=(3493 + 3397)/2 = 3445,例題2：,解： r21= 100/ 85 = 1.18 n有效 =16R2 r21/(r21-1)2=161.52 (1.18/0.18)2=1547（塊） L有效 = n有效H有效 = 15470.1 = 1.55m 即柱長為1.55米時(shí)，兩組分可以得到完全分離。,在一定的條件下，兩個(gè)組分的調(diào)整保留時(shí)間分別為85秒和100秒，要達(dá)到完全分離，計(jì)算需要多少塊有效塔板數(shù)？若填充柱的塔板高度為0.1cm，需要的柱長是多少？,例3：有一樣