第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

1、第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法,Scientific method-from idea to discoveries,Reading a paper 文獻(xiàn)閱讀（核心問(wèn)題） Experimental design research proposal 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（方法思路） Trust authorities risk assessment Doing experiment and research 實(shí)驗(yàn)操作（實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)） How to enter information into the notebook 實(shí)驗(yàn)記錄 Writing a paper 實(shí)驗(yàn)報(bào)告 Making a presentation 課

2、堂討論 Getting funded Scientific integrity 科學(xué)道德,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本原則,Trust authorities (文獻(xiàn)、儀器、實(shí)驗(yàn)材料、試劑、有經(jīng)驗(yàn)者等）； Risk assessment （實(shí)驗(yàn)周期、材料等）； 實(shí)驗(yàn)最佳條件的選擇； 對(duì)照實(shí)驗(yàn)：證明和確定結(jié)果的可靠性，排除可能出現(xiàn)的非特異性反應(yīng)； 極大地提高實(shí)驗(yàn)的成功率，節(jié)省時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，具有普遍意義的有效的工作思維方式。,第一節(jié)、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法 第二節(jié)、細(xì)胞組分的分析方法 第三節(jié)、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù) 第四節(jié)、用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物,第四節(jié)、用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物,由于基因在進(jìn)

3、化上的保守性以及遺傳密碼的通用性，使不同物種享有共同的分子機(jī)制。 模式生物通常具有個(gè)體較小，容易培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)繁殖快的特點(diǎn)。 常用的模式生物,第一節(jié)、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法,一、 光學(xué)顯微鏡技術(shù)（light microscopy） 二、電子顯微鏡技術(shù) (electron microscopy) 三、掃描遂道顯微鏡 (scanning tunnel microscope ),第二節(jié)、細(xì)胞組分的分析方法,一、用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物 二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、糖與脂質(zhì)等成分的顯示方法 三、特異蛋白抗原的定位與定性 四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸序列的定位與定性 五、應(yīng)用放射自顯影技術(shù)

4、研究生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的合成動(dòng)態(tài) 六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù),第三節(jié)、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù),一、細(xì)胞培養(yǎng) 二、細(xì)胞工程,一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（light microscopy),普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù) 相差和微分干涉顯微鏡技術(shù) 熒光顯微鏡技術(shù) 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) 熒光漂白恢復(fù)技術(shù),二、 電子顯微鏡技術(shù),1932年德國(guó)學(xué)者Ernst Ruska用波長(zhǎng)比光短得多的電子束作光源,發(fā)明了第一臺(tái)電子顯微鏡，大大提高了顯微鏡的分辨率。 電子顯微鏡的基本知識(shí) 電鏡與光鏡的區(qū)別 電鏡與光鏡光路圖比較 電子顯微鏡的基本構(gòu)造 主要電鏡制樣技術(shù)介紹 超薄切片的制備過(guò)程與要求和電鏡樣

5、品的染色 負(fù)染色技術(shù)（Negative staining）與金屬投影 復(fù)膜與冰凍蝕刻技術(shù)（Freeze etching） 掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）,三、掃描遂道顯微鏡（scanning tunnel microscope,STM),原理：掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時(shí)，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計(jì)算機(jī)顯示出來(lái)，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。 特點(diǎn)：具有原子尺度的高分辨本領(lǐng),側(cè)分辨率為0.10.2nm，縱分辨率可達(dá)0.001nm）； 可在真空、大氣、液體等多

6、種條件下工作； 非破壞性測(cè)量。 用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。,利用掃描隧道電子顯微鏡觀察到的DNA分子,普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù),分辨率是指區(qū)分開(kāi)兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離 光鏡樣本制作,熒光顯微鏡技術(shù)（Fluorescence Microscopy）,熒光顯微鏡的原理 熒光顯微鏡的應(yīng)用 直接熒光標(biāo)記技術(shù) 間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù) 綠色熒光蛋白：在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位,Green Fluorescence protein，GFP,從發(fā)光水母中提取的蛋白，在藍(lán)光的激發(fā)下，GFP發(fā)出綠光。該基因已被克?。ㄓ?38氨基酸構(gòu)成），并進(jìn)行了各種改造使

7、其熒光更強(qiáng)，或者可發(fā)出不同波長(zhǎng)的熒光，現(xiàn)在被廣泛用作報(bào)告基因。,直接熒光標(biāo)記技術(shù),利用細(xì)胞不同組分對(duì)不同熒光染料具有特異的吸附作用，對(duì)樣品進(jìn)行熒光染色。標(biāo)記熒光染料的樣品在熒光顯微鏡下經(jīng)過(guò)不同波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)后會(huì)發(fā)生不同顏色的熒光。 常用的熒光染料有以下幾種： DAPI：具有很好的DNA專(zhuān)一性 Fluorescein（熒光素）受到藍(lán)光激發(fā)后發(fā)綠色熒光 rhodamine（羅丹明）受到黃綠光激發(fā)后發(fā)紅色熒光 Cy3，受到激發(fā)后發(fā)橙色熒光,間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù),由于直接熒光標(biāo)記后樣品產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度較弱，同時(shí)無(wú)法特異性地顯示細(xì)胞內(nèi)生物大分子，因此在此基礎(chǔ)上發(fā)展起了間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)。通過(guò)熒光標(biāo)記的

8、抗體與細(xì)胞內(nèi)特異蛋白分子的結(jié)合來(lái)顯示這些蛋白分子在細(xì)胞中的分布。,抗原,抗原抗體 特異性結(jié)合,免疫熒光標(biāo)記,免疫酶標(biāo)記,利用較短波長(zhǎng)的光使樣品中熒光染料受到激發(fā)產(chǎn)生較長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光，用來(lái)檢測(cè)各種熒光分子的存在、分布及相對(duì)量，這種顯微鏡稱(chēng)為熒光顯微鏡。 根據(jù)激發(fā)光的路徑不同，可將熒光顯微鏡分為透射式和落射式兩種類(lèi)型。,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)（Laser Scanning Confocal Microscopy）,原理 應(yīng)用：排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)圖像反差和提高分辨率；通過(guò)光學(xué)切片，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。,相差和微分干涉顯微鏡技術(shù),相差顯微鏡（phase-contrast microscope

9、） 將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差(通過(guò)物鏡后“相位板”的作用），可用于觀察活細(xì)胞 。 微分干涉顯微鏡（differential-interference microscope） 以平面偏振光為光源，光線經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時(shí)間經(jīng)過(guò)樣品的相臨部位，然后再經(jīng)過(guò)另一棱鏡將這兩束光線會(huì)合，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差并具有很強(qiáng)立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。 錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhance microscopy),熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) （fluorescence resonance energy transfer,FERT),原理：當(dāng)供體發(fā)射的熒

10、光與受體發(fā)射團(tuán)分子的吸收光譜重疊，并且兩個(gè)探針的距離在10nm范圍以?xún)?nèi)時(shí)，就會(huì)發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生FERT現(xiàn)象。 在體內(nèi)，如果兩個(gè)蛋白質(zhì)分子的距離在10nm以?xún)?nèi)，一般認(rèn)為這兩個(gè)蛋白質(zhì)分子存在直接的相互作用。 應(yīng)用：用于檢測(cè)某一細(xì)胞中兩個(gè)蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。,熒光漂白恢復(fù)技術(shù) （fluorescence recovery after photobleaching,FRAP),原理：利用高能量激光束的照射使特定區(qū)域的熒光發(fā)生不可逆的淬滅，光漂白區(qū)熒光的恢復(fù)可通過(guò)非漂白區(qū)的熒光標(biāo)記分子在膜上或胞質(zhì)中運(yùn)動(dòng)至光漂白區(qū)來(lái)完成。 根據(jù)熒光恢復(fù)的速度可推算出膜蛋白或膜脂擴(kuò)散速度。,電

11、鏡與光鏡的基本區(qū)別,電鏡與光鏡光路圖比較,電子顯微鏡的基本構(gòu)造,電子顯微鏡主要由4部分組成：電子束照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和記錄系統(tǒng)。,電鏡樣品的染色,電鏡圖像的反差實(shí)質(zhì)上是電子密度的差異，它是由于樣品不同部分之間電子散射能力的差異所造成的。 由于生物樣品主要由C、N、O等元素構(gòu)成，這些元素原子序數(shù)低，散射電子的能力較弱，因此需要經(jīng)過(guò)染色來(lái)增加樣品的反差。利用重金屬鹽進(jìn)行染色后，樣品中的不同成分對(duì)各種“染料”有不同的親和性，結(jié)合重金屬較多的區(qū)域具有較強(qiáng)的電子散射能力，在電鏡下呈現(xiàn)為黑色，反之亦然。,超薄切片的制備過(guò)程與要求,細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)保存完好； 切片的厚度應(yīng)在50nm左右，較薄的切片分

12、辨率好，但反差較差，反之亦然； 切片應(yīng)耐受電子束的強(qiáng)烈轟擊，包埋介質(zhì)不發(fā)生變形或升華； 切片應(yīng)具有良好的反差 切片均勻。,金屬投影技術(shù)是電子顯微鏡中一種重要的增強(qiáng)背景和待觀察樣品反差的方法。由于投影時(shí)要求有一定的角度，朝向加熱絲的一面被金屬覆蓋，而背向加熱絲的樣品面和背景則不能被金屬覆蓋。在電鏡下觀察時(shí)，被金屬覆蓋的很暗，而未被覆蓋的則光亮。,掃描電鏡技術(shù),掃描電鏡的原理 主要用來(lái)觀察樣品表面的形貌特征 CO 2臨界點(diǎn)干燥法解決引起樣品變形的表面張力問(wèn)題 樣品在觀察前通常要噴鍍一層金膜 掃描電鏡景深長(zhǎng)，成像具有強(qiáng)烈的立體感。,一、用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物,用途：分離細(xì)胞器

13、與生物大分子及其復(fù)合物 差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分 密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離,二、 細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與質(zhì)脂等成分的顯示方法,利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過(guò)顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來(lái)判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和相對(duì)含量。 DNA特異性的顯示方法 多糖的顯示方法 脂類(lèi)物質(zhì)的顯示 細(xì)胞中各種酶的顯示,DNA特異性的顯示方法,Feulgen反應(yīng)： 利用酸水解去除細(xì)胞中的RNA，僅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脫氧核糖核酸的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基與希夫試劑反應(yīng)呈紫紅色。,多糖的顯示方法,PAS（過(guò)碘酸希夫氏）

14、反應(yīng) 利用過(guò)碘酸的強(qiáng)氧化作用破壞糖分子的CC鍵，使糖分子氧化產(chǎn)生雙醛基，自由的醛基與希夫試劑作用形成紫紅色產(chǎn)物。,脂類(lèi)物質(zhì)的顯示方法,對(duì)脂類(lèi)物質(zhì)的染色應(yīng)用的是物理的擴(kuò)散原理。蘇丹類(lèi)染料是脂溶性染劑，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以當(dāng)含有脂肪的標(biāo)本與蘇丹染料接觸時(shí)，它會(huì)脫離酒精而溶于脂類(lèi)結(jié)構(gòu)中從而顯色。,細(xì)胞中各種酶的顯示方法,由于酶易受外界條件影響而變性失活。因此對(duì)酶的顯示一般采取間接的方法進(jìn)行，對(duì)可以與酶發(fā)生特異性結(jié)合的底物進(jìn)行染色從而達(dá)到顯示酶的目的。因此在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中需在盡量保持酶的活性。,三、特異蛋白抗原的定位與定性,利用免疫學(xué)方法進(jìn)行胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位 免疫熒光技術(shù)：快速、靈敏、特異性強(qiáng)，

15、但其分辨率有限 免疫電鏡技術(shù)：免疫酶標(biāo)技術(shù)、免疫膠體金技術(shù) 細(xì)胞外蛋白質(zhì)的分析 蛋白電泳(SDS-PAGE) 免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot),細(xì)胞內(nèi)對(duì)于蛋白質(zhì)分子的定位技術(shù)包括免疫熒光、免疫印跡以及免疫電鏡等，這些技術(shù)都是將免疫學(xué)方法（抗原抗體特異結(jié)合）與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合用于研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)的分布和定位。,四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸序列的定位與定性,用標(biāo)記的核酸探針通過(guò)分子雜交確定特異核苷酸序列在染色體上或在細(xì)胞中的位置的方法稱(chēng)為原位雜交(in situ hybridization)。 把凝膠電泳分離開(kāi)的DNA片段，通過(guò)擴(kuò)散或電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，做成一個(gè)凝膠的復(fù)制品，這個(gè)過(guò)程

16、叫做印跡。將硝酸纖維素膜與帶有放射性標(biāo)記的探針雜交，通過(guò)放射自顯影就可以辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊的核苷酸序列。 利用標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)某一特定的DNA序列的方法稱(chēng)為Southern blot，檢測(cè)特定RNA序列的方法稱(chēng)為Northern blot。,五、應(yīng)用放射自顯影技術(shù)研究生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的合成動(dòng)態(tài),利用放射性同位素電離輻射對(duì)乳膠（含AgBr或AgCl)的感光作用，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究的一種細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究 步驟： 同位素標(biāo)記的生物大分子前體的摻入 細(xì)胞內(nèi)同位素所在位置的顯示,同位素標(biāo)記的前體物在生物大分子合成過(guò)程中摻入細(xì)胞內(nèi)即

17、標(biāo)記（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記） 標(biāo)記后的組織或細(xì)胞按常規(guī)方法制片 在暗室中像樣品表面均勻涂上一層乳膠， 曝光、顯影、定影后于顯微鏡下觀察。 細(xì)胞中銀顆粒所在的部位既代表放射性同位素的標(biāo)記部位,六定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù),流式細(xì)胞儀（Flow Cytometry） 用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量； 從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。 顯微分光光度測(cè)定技術(shù)（Microspectrophotometry） 利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對(duì)特異光譜吸收的原理，測(cè)定這些物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。 包括：紫外光

18、顯微分光光度測(cè)定法 可見(jiàn)光顯微分光光度測(cè)定法,一、細(xì)胞培養(yǎng),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)的概念和意義 原代培養(yǎng)細(xì)胞和傳代培養(yǎng)細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過(guò)程 細(xì)胞系（cell line）和細(xì)胞株（cell strain） 植物細(xì)胞培養(yǎng)：主要包括單倍體細(xì)胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）和原生質(zhì)體培養(yǎng)（體細(xì)胞培養(yǎng)）兩種類(lèi)型。 非細(xì)胞體系在細(xì)胞生物學(xué)研究中的作用 來(lái)源于細(xì)胞，而不具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與成分，但包含了進(jìn)行正常生物學(xué)反應(yīng)所需要的物質(zhì)（如供能系統(tǒng)和酶反應(yīng)體系等）組成的體系即為非細(xì)胞體系（cell-free system),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過(guò)程,取材 分離細(xì)胞（酶解或螯合劑） 選擇相同類(lèi)型的細(xì)胞 貼壁培養(yǎng) ：體外培養(yǎng)的細(xì)胞呈成纖維樣細(xì)胞與上皮樣細(xì)胞兩種基本形態(tài)； 傳代,細(xì)胞培養(yǎng)的概念和意義,細(xì)胞培養(yǎng)：將動(dòng)、植物細(xì)胞或組織從機(jī)體內(nèi)取出分散成單細(xì)胞懸液，給予必要的生長(zhǎng)條件，讓其在培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程。 細(xì)胞培養(yǎng)的意義 可以在離體條件下觀察研究細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律； 觀察細(xì)胞對(duì)于各種生物活性物質(zhì)的反應(yīng)； 通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)可以獲得大量性狀相