第五章 酶工程制藥技術(shù).ppt

1、第五章 酶工程制藥技術(shù),重點(diǎn)內(nèi)容：酶固化技術(shù)；,第一節(jié) 酶工程概述,一、酶工程簡(jiǎn)介（Enzyme Engineering） 酶工程是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合和發(fā)展而成的一門新的技術(shù)學(xué)科。它是從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特殊催化性能，并通過(guò)工程化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)。,酶工程這個(gè)名字出現(xiàn)在20世紀(jì)20年代，主要指自然酶制劑在工業(yè)上的規(guī)模應(yīng)用。 1953年，德國(guó)人提出了酶固定化技術(shù)； 1969年。日本人用固定化技術(shù)拆分了DL-氨基酸； 1971年，第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議提出酶工程的主要內(nèi)容：酶的生產(chǎn)、分離純化、沒(méi)得固定化、酶及固定化的反應(yīng)器、酶和固定化酶的應(yīng)用。,二、酶的基礎(chǔ)知識(shí) （一

2、）酶概念 由一切生物體活細(xì)胞產(chǎn)生的具有特殊催化功能的一類物質(zhì)。 （二）酶的化學(xué)本質(zhì) 通過(guò)對(duì)其化學(xué)成分析得出，其本質(zhì)為蛋白質(zhì)。,單純酶 催化活性僅由酶蛋白部分決定 結(jié)合酶 （全酶）=酶蛋白+輔因子,輔因子 必須基團(tuán)：這些基團(tuán)若經(jīng)化學(xué)修飾使其改變，則酶活性喪失。 活性部位：酶分子中直接與底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)部位。 活性部位 必需接團(tuán),輔酶 與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機(jī)物 輔基 與膜蛋白結(jié)合得緊密的小分子有機(jī)物 金屬激活劑 金屬離子作為輔助因子,結(jié)合基團(tuán) 專一性 催化基團(tuán) 催化性質(zhì),維持酶空間結(jié)構(gòu),（三）酶特點(diǎn) 作為催化劑，酶除了具有一般催化劑的特性外，還具有下面特點(diǎn)： （1）催化高

3、效性 催化效率是一般無(wú)機(jī)催化劑的106-1013倍 （2）專一性強(qiáng) 對(duì)底物嚴(yán)格選擇性，結(jié)構(gòu)專一性，立體異構(gòu)專一性，只對(duì)同種或同類物質(zhì)作用。 （3）反應(yīng)條件溫和 在常溫常壓下作用 （4）酶活受調(diào)節(jié)控制 通過(guò)多種形式調(diào)控， （5）具有不穩(wěn)定性,（四）酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),主要研究各種因素對(duì)酶催化反應(yīng)速度影響。具體因素有： （1）底物濃度：恒定條件下，底物濃度c較低時(shí)， c v （2）酶濃度 ：底物濃度一定時(shí)，正比于酶濃度 （3）pH：最適于pH值，高低都不行 （4）溫度：最適于溫度 （5）產(chǎn)物：催化產(chǎn)物可以占據(jù)酶分子特殊位點(diǎn) （6）抑制劑：活性中心或必需基團(tuán)性質(zhì)改變引起酶活性降低或喪失。 （7）激活劑：

4、與抑制相反，是一些離子或簡(jiǎn)單有機(jī)物,（五）酶來(lái)源,酶的生產(chǎn)目前多數(shù)直接從生物體中提取分離。非常少的是合成或基因工程。 早期酶的生產(chǎn)多以動(dòng)植物為主要原料，激肽釋放酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶。近年來(lái)，研究動(dòng)植物組織培養(yǎng)獲得，但周期長(zhǎng)，成本高。工業(yè)生產(chǎn)一般是以微生物為主要來(lái)源。目前上千品種酶，大多數(shù)ushi靠微生物生產(chǎn)的。,微生物來(lái)源的特點(diǎn)： （1）微生物種類多，凡是動(dòng)植物能獲得的酶，微生物都可以生產(chǎn)。 （2）微生物繁殖快，生產(chǎn)周期短，培養(yǎng)簡(jiǎn)便，并可控制發(fā)酵條件提高酶產(chǎn)量。 （3）微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，通過(guò)變異手段可以改造高產(chǎn)菌株。,常用的生產(chǎn)酶的微生物： E.Coli：是應(yīng)用最廣的產(chǎn)酶菌。分泌胞

5、內(nèi)酶，經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎得到。在工業(yè)上用于生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天門冬氨酸酶、青霉素?；傅?枯草桿菌：主要生產(chǎn)-淀粉酶、-半乳糖苷酶。 啤酒酵母：用于啤酒、酒精、飲料、面包生產(chǎn)。 曲酶(黑黃曲)：產(chǎn)糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、氨基?；负椭久?。 其他產(chǎn)酶菌：青霉、木霉、根霉菌、鏈霉菌等。,（六）酶分類,1969年，國(guó)際酶協(xié)會(huì)規(guī)定，按照催化的化學(xué)反應(yīng)類型，將酶分成6大類： （1）氧化還原酶：催化氫原子或電子轉(zhuǎn)移、或在基質(zhì)中加氧原子導(dǎo)入 羥基反應(yīng)，包括脫氫酶、還原酶、氧化酶、過(guò)氧化氫酶、加氧酶羥化酶。 （2）轉(zhuǎn)移酶： 催化將原子團(tuán)由一個(gè)基質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)基質(zhì)。轉(zhuǎn)移基團(tuán)：氨基、羧基、甲基、

6、酰基、磷酸基團(tuán) （3）水解酶： 催化由水分子介入使基質(zhì)共價(jià)鍵水解反應(yīng)，切斷鍵有酯鍵、糖苷鍵、醚鍵、肽鍵。 （4）裂解酶： 催化用水解以外的方法使原子團(tuán)和基質(zhì)分離，在基質(zhì)上生成雙鍵反應(yīng)， （5）異構(gòu)酶： 催化不伴有基質(zhì)分子水解、轉(zhuǎn)移、氧化還原的分子異構(gòu)反應(yīng)。 （6）連接酶： 催化將ATP或類似三磷酸化合物的焦磷酸鍵切斷，使連個(gè)分子連接反應(yīng)。,三 、酶工程研究?jī)?nèi)容,1、酶分離純化、大批量生產(chǎn)及新酶和酶發(fā)的應(yīng)用開(kāi)發(fā)； 2、酶和細(xì)胞的固化及酶反應(yīng)器的研究， 3、酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用及遺傳修飾酶的研究 4、酶的分子改造和化學(xué)修飾，結(jié)構(gòu)與功能研究； 5、有機(jī)相中酶反應(yīng)研究； 6、酶的抑制劑、激活劑開(kāi)

7、發(fā)與應(yīng)用研究； 7、抗體酶、核酸酶研究； 8、模擬酶、合成酶及酶分子的人工設(shè)計(jì)、合成研究。,四、酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用,1、在疾病診斷方面應(yīng)用 由于酶具有專一性強(qiáng)、催化效率高、作用條件溫和特點(diǎn)，酶學(xué)診斷已經(jīng)成為可靠、簡(jiǎn)便、快速的診斷方法。 酶學(xué)診斷方法包括：根據(jù)體內(nèi)原有酶活力變化診斷某些疾?。焕妹竵?lái)測(cè)定體內(nèi)某些物質(zhì)含量，從而診斷某些疾病。,2、在疾病治療應(yīng)用酶抑制劑 酶可以作為藥物治療多種疾病，用于治療疾病的酶稱藥用酶。效果顯著，副作用小。消化類：主要是胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纖維素酶、木瓜酶、凝乳酶、無(wú)花果酶、菠蘿酶等。 抗炎凈創(chuàng)類：目前在治療上發(fā)展最快。 多數(shù)為蛋白水解酶，分解發(fā)炎部纖維蛋白

8、的凝結(jié)物，消除傷口周圍壞疽、腐肉和碎屑。 有些可以分解膿液中核蛋白，達(dá)到凈潔創(chuàng)口、消炎目的。 主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、雙鏈酶。,血凝和解凝類：這類從血液中提取。 凝血酶 使血液凝固，防止微血管出血 纖維蛋白溶解酶 溶解血塊，治療血栓靜脈炎、冠狀動(dòng)脈栓塞。 抑肽酶 體外循環(huán)手術(shù)，可以減少心臟外科手術(shù)后的滲雪，消除滲血導(dǎo)致死亡。,解毒類：解除體內(nèi)某種藥物產(chǎn)生的有害物質(zhì)。 有青霉素酶、過(guò)氧化氫酶、組織胺酶,3、在藥物生產(chǎn)應(yīng)用 利用酶的催化作用將前體物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗幬?。不少貴重藥物都是由酶法生產(chǎn)。 4、在分析檢測(cè)方面 酶法檢測(cè)或酶法分析：ELISA，免疫組織化學(xué)，western blot中的HRP,第二

9、節(jié) 酶的固定化技術(shù),游離酶的缺點(diǎn)： 酶是一種蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差，對(duì)熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑等均不穩(wěn)定。 不能回收，也使產(chǎn)物中混雜酶蛋白。 分離純化困難。 因此，需要將酶加以固定化，使得酶在不利條件下既具有活性，也可以反復(fù)利用。,一、固定化生物技術(shù)概念 通過(guò)化學(xué)或物理的手段將酶或游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)利用。 固定化酶：固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。 制備固定化酶的過(guò)程就是酶的固定化。,優(yōu)點(diǎn)： （1）可提高穩(wěn)定性。 （2）能回收，易與產(chǎn)物分離，可反復(fù)使 用。 （3）利用效率高 缺點(diǎn)： (1)存在擴(kuò)散限制。適于催化小分子物質(zhì)。 (2)酶活性下降。,二、固

10、定化酶制備原則 （1）、必須注意維持酶的催化活性及專一性 （2）、酶和載體結(jié)合牢固 （3）、固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù) 化。 （4）、固定酶應(yīng)有最小空間位阻 （5）、固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性 （6）、固定化酶應(yīng)是廉價(jià)的。,三、酶的固定化方法 酶的固定就是通過(guò)載體將酶限制或固定與特定空間位置，使酶不易隨水流失即運(yùn)動(dòng)受限制、而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。 固定化酶在較為簡(jiǎn)單的制藥工藝中發(fā)展較快，像氨基酸的酶法合成、氨芐西林的酶法生產(chǎn)、治療用酶的生產(chǎn)。但在較為復(fù)雜的制藥工藝中，固定化酶應(yīng)用比較緩慢，主要因?yàn)樯锎呋钢荒芙鉀Q一步或幾步反應(yīng)。而且成本較高，利潤(rùn)不高。,酶固定化方法：,1.吸附法（a

11、dsorption） 依據(jù)帶電的酶或細(xì)胞和載體之間的靜電作用，使酶吸附于惰性固體的表面或離子交換劑上。,根據(jù)吸附劑的特點(diǎn)分: （1）物理吸附法 作用力：氫鍵、疏水鍵 常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、 硅膠、羥基磷灰石、纖維素等。 （2）離子結(jié)合法 作用力：離子鍵 常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素,優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，操作簡(jiǎn)便，酶活力損失少。 缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附。,2.共價(jià)偶聯(lián)法 借助共價(jià)鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。,（1）載體：親水載體優(yōu)于疏水載體 如:天然高分子衍生物: 纖維素 葡聚糖凝膠 親和性好，機(jī)械性能差 瓊脂糖 合

12、成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 機(jī)械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu) 尼龍,（2）偶聯(lián)方法： 偶聯(lián)成功與否取決于： 載體：功能基團(tuán)（芳香氨基，羧基，羧甲基等） 酶分子：側(cè)鏈非必需基團(tuán)（羧基，巰基，羥基，酚基，咪唑基） 常用的偶聯(lián)反應(yīng)有：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、烷基化法等。,優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，不會(huì)輕易脫落，可連續(xù)使用。 缺點(diǎn)：反應(yīng)條件較激烈，易影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性。,3.交聯(lián)法 借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)的固定化方法。 雙功能試劑： 常用的是戊二醛 O O H C CH2 CH2 CH2 C H,戊二醛有兩個(gè)醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng),使酶蛋白交聯(lián)。此法與共價(jià)偶聯(lián)

13、法利用的均是共價(jià)鍵，不同之處：交聯(lián)法不使用載體。,交聯(lián)反應(yīng)既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內(nèi)。 酶濃度低時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，酶仍保持溶解狀態(tài)。 酶濃度高時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。,缺點(diǎn)： (1)反應(yīng)條件激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失大。 (2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來(lái)不便。,4. 包埋法（entrapment）,將酶用物理的方法包埋在各種載體（高聚物）內(nèi)。分為： 網(wǎng)格型：將酶包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。 微囊型：將酶包埋在高分子半透膜中。,1）網(wǎng)格型包埋法 又稱凝膠包埋法 使用的多孔載體及其特點(diǎn),海藻酸鈣凝膠包埋法： 滴至 海藻酸鈉溶液E (or cell) C

14、aCl2 溶液中 IE(or IC) 角叉菜膠包埋法： 滴至 角叉菜膠E (or cell) KCl 溶液中 IE (or IC) 聚丙烯酰胺凝膠包埋法： AP Acr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) TEMED,2）微囊型包埋法 又稱半透膜包埋法 將一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜內(nèi) 。半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約25nm。 半透膜孔徑酶分子孔徑，小于半透膜孔徑的小分子底物和產(chǎn)物可以自由進(jìn)出，被稱為“人工細(xì)胞”。,與網(wǎng)格型包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點(diǎn)： 1）固定化酶顆粒小，有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散。 2）半透膜能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進(jìn)入，注入體內(nèi)既可避免引起免

15、疫過(guò)敏反應(yīng)，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。 缺點(diǎn)：反應(yīng)條件要求高,制備成本也較高。,包埋法是目前應(yīng)用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比： 優(yōu)點(diǎn)：不與酶蛋白氨基酸殘基反應(yīng)，很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。 缺點(diǎn)：只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。,各種固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較,四、固定化酶性質(zhì)與形狀 1、固定化酶形狀 根據(jù)底物和產(chǎn)物性質(zhì)、基質(zhì)材料的性能、固定化方法、酶促反應(yīng)性質(zhì)、反應(yīng)器類型和應(yīng)用目的不同，固定化酶的形狀是不一樣的，常見(jiàn)有以下4種類型。,（1）顆粒狀 包括酶珠、酶塊、酶片和酶粉4種。 +,海藻膠溶液,釀酒酵母,噴珠機(jī),優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單 顆粒比表面積大

16、轉(zhuǎn)化效率高 適合于各種類型反應(yīng)器,（2）纖維狀 用纖維素和酶混合，經(jīng)過(guò)噴絲制得酶纖維，該固定酶具有比表面積大、轉(zhuǎn)化率高特性，但只適合于填充床反應(yīng)器。,（3）膜狀 通過(guò)偶聯(lián)法將酶偶聯(lián)到濾膜上，或用硝酸纖維、骨膠原和明膠等載體，通過(guò)戊二醛交聯(lián)制成膜狀酶。 優(yōu)點(diǎn)：表面積大，滲透阻力小，破碎后也可用于填充床反應(yīng)器。目前已有木瓜酶、過(guò)氧化物酶、氨基?；傅?。,（4）管狀 用一些像尼龍、聚丙烯酰胺等管狀載體活化后與酶偶聯(lián)制得管酶。目前有糖化酶、轉(zhuǎn)化酶和脲酶等被開(kāi)發(fā)。由于機(jī)械前強(qiáng)度大，可以切短后用于填充床反應(yīng)器，也可以組裝成列管式反應(yīng)器。,2、固定化酶性質(zhì) 天然酶經(jīng)過(guò)固定化后，其反應(yīng)體系由均相變?yōu)榉蔷?，?/p>

17、上可能受到擴(kuò)散抑制、空間位阻等，酶學(xué)活性將受到影響。 （1）酶活力變化 大多酶經(jīng)過(guò)固定化后，活性通常低于天然（有例外）。,一般都會(huì)考慮相應(yīng)的固定化過(guò)程可能對(duì)酶的影響，避免損害酶的活性中心，有時(shí)在固定化反應(yīng)體系中會(huì)加入抑制劑、底物或產(chǎn)物以保護(hù)酶的活性中心。乳糖酶的固定化就采用在其抑制劑葡萄糖-內(nèi)酯存在下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠的包埋，如此可獲得高活力的固定化乳糖酶。,2、酶穩(wěn)定性的變化 通常，大部分酶固定化后，雖然其活力有所下降，但其穩(wěn)定性大都有不同程度的改善。主要包括： 操作穩(wěn)定性:半衰期在1個(gè)月以上，可以認(rèn)為其具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值； 貯藏穩(wěn)定性:一般固定化后應(yīng)立即使用，但保存方法得當(dāng)則其貯藏很長(zhǎng)

18、時(shí)間后，其酶活仍然具有可操作性； 對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性:固定化酶對(duì)蛋白酶具有很高的穩(wěn)定性，但游離酶對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性則很低。,3、酶學(xué)特性的變化 經(jīng)過(guò)固定化后，酶的一些特性如： 底物專一性 最適pH 最適溫度 米氏常數(shù) 最大反應(yīng)速度 均可能發(fā)生變化。,五、固定化酶反應(yīng)器 用于酶催化反應(yīng)的裝置稱為酶反應(yīng)器，它可用于溶液酶，也可用于固定化酶。 （1）間隙式攪拌罐反應(yīng)器 用于游離酶反應(yīng)后隨即放料。 （2）連續(xù)流動(dòng)攪拌罐反應(yīng)器 連續(xù)進(jìn)料、連續(xù)出料 （3）填充床反應(yīng)器 固定化酶添充于床層內(nèi)。反應(yīng)器內(nèi)的流體的流動(dòng)形態(tài)為平推流形。底物以恒定流速通過(guò)反應(yīng)床。,（4）流化床反應(yīng)器 底物以足夠大的流速向上通過(guò)固定化酶床

19、層，使固體顆粒處于流化狀態(tài)，達(dá)到混合的目的。 （5）循環(huán)反應(yīng)器 部分反應(yīng)液流出和新加入底物流入液混合，在進(jìn)入反應(yīng)床進(jìn)行循環(huán)。,（6）連續(xù)流動(dòng)攪拌罐超濾反應(yīng)器 由連續(xù)流動(dòng)攪拌罐反應(yīng)器和超濾裝置組合而成的反應(yīng)器。它在連續(xù)流動(dòng)攪拌罐的出口處裝有半透膜。可以使酶反復(fù)使用，并且使相對(duì)分子質(zhì)量小的產(chǎn)物和相對(duì)分子質(zhì)量大的底物分開(kāi)，使底物徹底轉(zhuǎn)化。 （7）其它有 淤漿反應(yīng)器、滴流床反應(yīng)器等。,六、反應(yīng)器的選擇依據(jù) 1、根據(jù)固定化酶的形狀來(lái)選擇 2、根據(jù)底物的物理性質(zhì)來(lái)選擇 3、根據(jù)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性來(lái)選擇 4、根據(jù)外界環(huán)境對(duì)酶的穩(wěn)定性的影響來(lái)選擇 5、根據(jù)操作要求及反應(yīng)器費(fèi)用來(lái)選擇,第三節(jié) 酶工程制藥實(shí)用技術(shù),

20、酶工程制藥體現(xiàn)在兩個(gè)方面：1、作為治療用的藥用酶；2、酶作為生物催化劑在傳統(tǒng)化學(xué)合成制藥中應(yīng)用。 酶工程制藥種類： 降壓藥物、降血脂藥物或中間體、半合成抗生素、轉(zhuǎn)化甾體、合成氨基酸。,一、藥用酶生產(chǎn) 藥用酶：用于預(yù)防、治療和診斷疾病的一類酶制劑。酶在新成代謝中催化生化反應(yīng)，酶一旦出現(xiàn)問(wèn)題，身體就會(huì)出現(xiàn)疾病。 （一）、藥用酶來(lái)源 酶普遍存在于動(dòng)植物和微生物之中，可以直接分離得到，也可以通過(guò)化學(xué)法合成，但目前主要通過(guò)動(dòng)植物和微生物中提取。,（二）、藥用酶生化制備 選擇合適材料 材料預(yù)處理 提取 純化 （1）原材料選擇注意問(wèn)題 、了解酶在材料中分布 、不同生物發(fā)育階段酶含量差異 、用動(dòng)植物組織時(shí)，應(yīng)

21、宰殺后立即取材 、選材注意來(lái)源豐富，并可以獲得多種酶產(chǎn)品。,（2）、生物材料預(yù)處理 、機(jī)械處理 、反復(fù)凍融處理 、制備丙酮粉 、微生物細(xì)胞預(yù)處理,（3）、酶提取 把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來(lái)的過(guò)程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。常用方法： 、水溶液法 、有機(jī)溶液法 、表面活性劑法 提取目標(biāo)： a. 將目的酶最大限度地溶解出來(lái)。 b. 保持生物活性。,注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活， 一般采用低溫下（010）操作。 提取原則： a. 相似相溶。 b. 遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。,離心分離： 基本原理 （1）. 離心力 Fc = m ac m r 2

22、 m r （2 N/60）2 N為離心機(jī)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （r/min ）； Fc通常以相對(duì)離心力RCF（relative centrifugal force）表示，即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用g（或數(shù)字g）表示。,RCF = m r （2 N/60）2 /mg= 1.12 10-5 N2 r 此公式描述了相對(duì)離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系 旋轉(zhuǎn)半徑用r平均代替 r平均=1/2（r大+r小）cm 通常： 低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：4000r/min。 高速離心（超速），常以相對(duì)離心力（RCF）表 示，如：65000g。 兩者可換算或查測(cè)算圖。,計(jì)算近似RCF的列線圖,（

23、2）. 沉降系數(shù):（sedimentation constant） 指單位離心力下顆粒的沉降速度（sedimentation velocity），用S表示。 由于許多生物大分子的S值很小，所以定義10 13 s 為一個(gè)沉降單位，1S = 11013 s。 常用S表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞細(xì)胞器的大小，如16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在1 200之間。,（3）.離心機(jī)的種類 按離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同， 分為： 常速（低速） 高速 超速,離心機(jī)的種類,實(shí)驗(yàn)室離心機(jī),溫度類型：常溫及冷凍 超速離心機(jī)均為冷凍型。 使用冷凍離心機(jī)時(shí)提前降溫，預(yù)冷離心頭。 使用超速離心機(jī)時(shí)先抽真空。,離心的形式,角式及

24、外擺式：外擺式一般為低速， 角式由低速到超速均有。,角式離心機(jī)和離心頭（轉(zhuǎn)子）,角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。,離心機(jī)的大?。郝涞厥郊芭_(tái)式,小臺(tái)式離心機(jī),離心管,材質(zhì)：玻璃，塑料 強(qiáng)度：和離心速度相配 大?。汉娃D(zhuǎn)子配套 高速超速管要加蓋,離心機(jī)操作,平衡、定溫、定速、定時(shí)。,常用離心方法 差速離心法 沉降速度法 密度梯度離心 沉降平衡法 等密度梯度離心,（1）差速離心 （differential centrifugation） 采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。 特點(diǎn)：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單 。 缺點(diǎn)： 1）

25、分離效果較差， 不能一次得到純顆粒。 2）壁效應(yīng)嚴(yán)重。 3）沉降的顆粒受到擠壓。,差速離心分離示意圖 （a）離心前的懸浮液 （b）（e）離心不同時(shí)間后顆粒的沉降情況,（2）密度梯度離心 （density gradient centrifugation） 樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。 常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。 特點(diǎn)： 區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì) 顆粒的密度。 適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。,密度梯度離心示意圖 （a）離心前 （b）離心后,（3）. 等密度梯度離心 又稱沉降平衡離心 （sedimentation equili

26、brium centrifugation）。 根據(jù)顆粒的密度不同而進(jìn)行分離。 離心時(shí)，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆粒或向下沉降，或向上漂浮，達(dá)到與其相同的密度時(shí)不再移動(dòng)，形成區(qū)帶。常用氯化銫（CsCl）作為梯度介質(zhì)。 特點(diǎn)： 介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。 適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。,等密度梯度離心示意圖 （a）離心前； （b）離心后,沉降速度離心和沉降平衡離心的特點(diǎn),總結(jié)： 等密度梯度離心是一種測(cè)定顆粒浮力密度的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。 差速離心是一種動(dòng)力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。 密度梯度

27、離心兼有以上兩種方法的特點(diǎn)，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。,（4）酶純化 純化是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，酶不同，其純化工藝也有較大差異，判斷一個(gè)純化工藝優(yōu)劣主要看2個(gè)指標(biāo)：a、酶比活；總活力回收率。目前常見(jiàn)的純化方法有：鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、選擇性變性法、柱層析法、電泳法和超濾法。這些方法與蛋白質(zhì)純化方法相同。,酶純化的基本原則： 建立一個(gè)方便靈敏的分析方法； 選擇有效的純化方法，盡可能減少純化步驟； 常在低溫（4）條件下進(jìn)行純化，以避免酶的變性。,（1）去除雜質(zhì) 酶提取液中，除了酶，還有大量的雜蛋白、 多糖、色素、脂類和核酸等，因此需要清除這些雜 質(zhì)。 調(diào)pH和加熱沉淀 蛋白質(zhì)表面變性 選擇性變性

28、 降解或沉淀核酸 結(jié)合底物保護(hù)法除去雜蛋白,（2）脫鹽 在酶純化時(shí)，常要脫鹽處理，最常見(jiàn)的是透析和凝膠過(guò)濾。 透析 使用固定尺寸和穩(wěn)定孔徑的玻璃紙袋通過(guò)分子擴(kuò)散原理對(duì)酶液進(jìn)行處理，將鹽分脫去，通過(guò)化學(xué)試劑或電導(dǎo)率儀進(jìn)行檢測(cè)。 凝膠過(guò)濾 這是目前最常用的方法，既可除去小分子鹽，也可以除去其他小分子的物質(zhì)。常見(jiàn)凝膠有：Sephadex（G-10、G-15、G-25)、 Bio-Gel（P-2、P-4、P-6、P-10）,（3）濃縮 經(jīng)過(guò)雜質(zhì)處理后，純酶需要濃縮，常見(jiàn)的有：冷凍干燥、離子交換、超濾、凝膠吸水、聚已二醇吸水。 冷凍干燥：最有效方法，將酶液制成干粉；既濃縮，又不易使酶變性；便于長(zhǎng)期保存。

29、樣品最好是水溶液！起泡！ 離子交換：常見(jiàn)交換劑有DEAE-Sephadex A50(二乙氨基-乙基-葡萄糖凝膠)、PAE-Sephadex A50，幾乎酶蛋白全部被吸附，通過(guò)改變洗脫液pH值或離子強(qiáng)度洗脫。 超濾：操作簡(jiǎn)單、快速溫和，但影響因素較多，膜通透性、溶質(zhì)形狀、大小及擴(kuò)散性、壓力、溫度等 凝膠吸水：Sephadex Bio-Gel具有吸水和吸相對(duì)分子量較小的化合物性質(zhì)，用它們的干粉和要濃縮的酶液混合。,（4）酶結(jié)晶 當(dāng)酶提純到50%以上時(shí)，進(jìn)行結(jié)晶處理，隨著酶結(jié)晶形成，酶純度進(jìn)一步提高，結(jié)晶既是提純結(jié)果也是提純手段。酶結(jié)晶明顯特征是有序性，蛋白質(zhì)分子在晶體中以對(duì)稱性排列。使酶形成晶體的

30、條件是降低酶分子自由能。 酶結(jié)晶方法 緩慢改變酶蛋白的溶解度，使其略處于過(guò)飽和狀態(tài)，改變酶溶解度方法： a 鹽析法、b 有機(jī)溶劑法、c 符合結(jié)晶法 d 透析平衡法、e 等電點(diǎn)法,結(jié)晶條件選擇 在酶結(jié)晶時(shí)，選擇一定條件和相應(yīng)的結(jié)晶方法是保證能結(jié)晶和不引起酶活力喪失的關(guān)鍵因素。以下是影響酶結(jié)晶的重要因素 A 酶液純度 酶純?cè)礁呔驮揭仔纬山Y(jié)晶，雜質(zhì)影響單晶長(zhǎng)大 B 酶濃度 高濃度母液利于晶體形成，一般為5-10mg/ml。 C 溫度 低溫利于結(jié)晶，一般4以下或室溫以下。 D 時(shí)間 時(shí)間越久，酶結(jié)晶性能越好，微晶快，長(zhǎng)大慢。 E pH值 稍微改變值就可以影響到晶體好壞與形成與否。 F 金屬離子 金屬離

31、子有助于結(jié)晶，并長(zhǎng)大。鈣鋅 G 晶種 不易結(jié)晶的酶，一般要加微量晶種才可結(jié)晶。,（5）酶分離和純化中注意問(wèn)題 提純時(shí)，酶純?cè)礁?，穩(wěn)定性越差，要注意： 防止酶蛋白變性 避免高溫、pH值忽高忽低，應(yīng)在4左右中性條件下操作。不可激烈攪拌避免產(chǎn)生氣泡，以及與重金屬和變性劑接觸。 防止輔助因子流失 有些酶具有輔酶、輔基和金屬輔助因子，在操作時(shí)應(yīng)避免輔助因子流失。 防止酶被蛋白水解酶降解 在微生物培養(yǎng)液中含有較多蛋白水解酶，及時(shí)清除。,（三）藥用酶微生物發(fā)酵法 現(xiàn)代生產(chǎn)的酶制劑大都來(lái)自微生物體的發(fā)酵。 1、高產(chǎn)菌株選育 菌種是發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)酶制劑的重要條件，優(yōu)良菌種更是重中之重。優(yōu)良菌種的分離與選育： （1

32、）從自然界中直接篩選 （2）用物理或化學(xué)方法誘變 （3）基因重組和細(xì)胞融合構(gòu)建基因工程菌,2、 工藝條件優(yōu)化 優(yōu)良菌株是酶生產(chǎn)的先決條件，要能夠大量產(chǎn)酶以及質(zhì)量較好的酶，還必須進(jìn)行發(fā)酵條件的篩選，包括：培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基、溫度、pH值和溶氧量等。同時(shí)，酶的分離純化和制備工藝，這都決定著酶生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。,3、培養(yǎng)方法 目前主要利用固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。 （1）固體培養(yǎng)法 也稱麩曲培養(yǎng)法，利用麩皮或米糠為主，再加些谷糠、豆餅，加水?dāng)嚢?。目前釀造業(yè)糖化曲都是采用固體法培養(yǎng)。固體法的缺點(diǎn)：,（2）液體法 利用液體培養(yǎng)基是微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶。依據(jù)通氣方法不同分為：液體表面培養(yǎng)和液體深層培養(yǎng)。,4、影響酶

33、產(chǎn)量因素 菌種產(chǎn)酶性能是決定發(fā)酵產(chǎn)量的重要因素，發(fā)酵工藝；培養(yǎng)基成分；T、pH、通氣、攪拌等，誘導(dǎo)劑和抑制劑。 （1）溫度 既可影響微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶，也影響已形成酶的穩(wěn)定性。發(fā)酵溫度高于種子溫度，利于產(chǎn)酶。 （2）發(fā)酵pH 可以影響菌體生長(zhǎng)，改變微生物代謝途徑和產(chǎn)物性質(zhì)。,（3）通氣和攪拌 用于酶生產(chǎn)的都是好氧微生物，不同菌種對(duì)通氣也有差異，一般通過(guò)溶氧儀精確測(cè)定。深層發(fā)酵通氣還要不斷攪拌增加溶氧量，也利于熱交換和物質(zhì)交換。 （4）泡沫和消泡劑 發(fā)酵中產(chǎn)生的泡沫阻礙CO2氣體排除，也就影響微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成。一般采用消泡劑來(lái)去除泡沫，消泡劑：天然油脂、醇類、脂肪酸類、胺類等。,（5）添加

34、誘導(dǎo)劑和抑制劑 部分誘導(dǎo)酶，在無(wú)誘導(dǎo)物時(shí)，酶無(wú)法形成，當(dāng)有底物或結(jié)構(gòu)類似物時(shí)就可以合成酶，白地霉菌合成脂肪酸。,（四）酶類藥物生產(chǎn)實(shí)例 1胃蛋白酶 藥用蛋白酶是胃液中多種蛋白水解酶混合物，有胃蛋白酶、組織蛋白酶、膠原蛋白酶。 臨床治療：因食蛋白性食物過(guò)多所致消化不良及病后恢復(fù)期消化機(jī)能減退 存在于：哺乳動(dòng)物胃液。 目前主要通過(guò)豬牛羊的胃粘膜中提取。,（1）性質(zhì) （2）生產(chǎn)工藝 工藝流程 豬胃粘膜酸解液酶液成品 工藝過(guò)程及控制要點(diǎn) 結(jié)晶胃蛋白酶的制備 20%乙醇 過(guò)濾 硫酸鎂飽和,酸解、過(guò)濾 水、鹽酸,45-48,3-4h,脫脂除雜 氯仿或乙醚,24-28h,濃縮干燥,40以下,胃蛋白酶粗粉,胃

35、蛋白酶液,硫酸至pH3.0 5靜置20h,濾液,鹽析物,溶解物,pH 3.8乙醇,pH 2.0乙醇,析出針狀胃 蛋白酶,（3）質(zhì)量控制 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)中國(guó)藥典，完全消化3000g凝固卵蛋白/1g胃蛋白酶； 109干燥4h，減重不得超過(guò)4%； 活力測(cè)定 根據(jù)分光光度法，在波長(zhǎng)275nm處測(cè)吸收度 每克樣品酶活單位= A是樣品平均吸收值；AS對(duì)照平均吸收值；W取樣量 ；WS對(duì)照品中絡(luò)氨酸含量g/ml ；n樣品稀釋倍數(shù) 每分鐘內(nèi)催化水解血紅蛋白生成1mol絡(luò)氨酸的酶量為1個(gè)蛋白酶活力單位。,（1）工藝流程 發(fā)酵法生產(chǎn)-以大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)。 大腸桿菌種子級(jí)菌種加入玉米漿，發(fā)酵罐、37下培養(yǎng)7小時(shí)取發(fā)酵液