儀器分析在醫(yī)藥的應(yīng)用

1、儀器分析在藥物分析的應(yīng)用班級：12食品 姓名：李娜 學(xué)號： 【摘要】近年來，隨著儀器分析在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，越來越多的的新技術(shù)新方法被應(yīng)用在醫(yī)藥制造分析方面，本文對醫(yī)藥領(lǐng)域方面的儀器分析應(yīng)用整理并統(tǒng)一綜述?！娟P(guān)鍵詞】儀器分析 醫(yī)藥應(yīng)用制造 高效毛細管電泳 應(yīng)用【正文】高效毛細管電泳(HPCE)又叫毛細管電泳(CE)，是必高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管及其內(nèi)壁為通道和載體，利用樣品各組分之間電泳淌度或分配行為的差異而實現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、生物技術(shù)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)和環(huán)境保護等領(lǐng)域。采用HPCE法能數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)可沖洗再生，不易污染，能直接進樣水溶性蛋白樣品。此外

2、，它呵在185210nm波長下進行監(jiān)測，因其避免了高效液相色譜儀(HPLC)在短紫外波長測定時易受到所用溶劑截止波長的干擾，這樣就可測定分子中不帶生色團的藥物，擴大了監(jiān)測范圍1，這些優(yōu)點與傳統(tǒng)藥物分析方法相此更突出了HPCE在這一領(lǐng)域巾的優(yōu)勢地位，使毛細管電泳在體內(nèi)藥物分析領(lǐng)域有著極其廣闊的應(yīng)用前景。1. 概述1.1 電泳及其發(fā)展介紹 電泳是帶電粒子在電場力作用下，以不同的速度向電荷相反方向遷移的現(xiàn)象.稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實現(xiàn)分離。1937年，蒂塞利烏斯將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分

3、離出白蛋白和、球蛋白；發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀；1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎。1.2 傳統(tǒng)電泳和高效毛細管電泳的比較 傳統(tǒng)電泳：（紙電泳，凝膠電泳等）操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。高效毛細管電泳(HPCE)：是指離子或帶電粒子以毛細管為分離室,以高壓直流電場為驅(qū)動力,依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的液相分離分析技術(shù)。高效毛細管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進：一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細管；二是采用了高達數(shù)千伏的電壓。1.3HPCE的特點高靈敏度：常用紫外檢測器的檢測限可達10-1310-15mo

4、l，激光誘導(dǎo)熒光檢測器(LIF)則達10-19-10-21。高分辨率：每米理論塔板數(shù)為幾十萬，高者可達幾百萬乃至幾千萬。高速度：許多分析可在10分鐘內(nèi)完成，有的可在60秒內(nèi)完成。所需樣品少：只需納升(10-9升)的進樣量。成本低：只需少量(幾毫升)的流動相和低廉的毛細管。應(yīng)用范圍廣：除分離生物大分子（肽、蛋白、DNA和糖等）外，還可用于小分子(氨基酸、藥物等)及離子(無機及有機離子等)，甚至可分離各種顆粒(如硅膠顆粒等)。 2. 高效毛細管電泳的原理2.1 CZE的基本原理HPCE選用的毛細管一般內(nèi)徑約50um(20um200um)，外徑375um，有效長度50cm(7cm100cm)，以高壓

5、電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間濃度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。其結(jié)構(gòu)包括一個高壓電源，一根毛細管，一個檢測器及兩個供毛細管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶。在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場作用下，以不同速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象叫作電泳。HPCE所用的大理石英毛細管柱，在pH3情況下，其內(nèi)表面帶負電，和溶液接觸時形成了一雙電層。在高電壓作用下，雙電層中的水合陽離子引起流體整體地朝負極方向移動的現(xiàn)象叫電滲，粒子在毛細管內(nèi)電解質(zhì)中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和。正離子的運動方向和電滲流二致，故最先流出；中性粒子的電泳流速度

6、為“零”，故其遷移速度相當于電滲流速度；負離子的運動方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳流速度，故在中性粒子之后流出，從而因各種粒子遷移速度不同而實現(xiàn)分離。 2.2 MECC的基本原理MECC是把一些離子型表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉，SDS)加到緩沖液中，當其濃度超過臨界濃度后就形成有一疏水內(nèi)核、外部帶負電的膠束。雖然膠束帶負電，但一般情況下電滲流的速度仍大于膠束的遷移速度，故膠束將以較低速度向陰極移動。溶質(zhì)在水相和膠束相(準固定相)之間產(chǎn)生分配，中性粒子因其本身疏水性不同，在二相中分配就有差異，疏水性強的和膠束結(jié)合牢，流出時間就長，最終按中性粒子疏水性不同得以分離。MECC使

7、HPCE能用于中性物質(zhì)的分離，拓寬了HPCE的應(yīng)用范圍，是對HPCE極大的貢獻。23. 高效毛細管電泳儀3.1儀器流程與主要部件包括電腦控制系統(tǒng)和主機，主機有進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。電泳儀工作示意圖 工作流程如下：移開進樣端的緩沖溶液池換上樣品管進樣再換上緩沖溶液池加上分離電壓，電泳檢測。3.2各系統(tǒng)詳述3.2.1進樣系統(tǒng)3.2.1.1流體力學(xué)進樣方式 進樣端加壓，出口端抽真空，虹吸進樣。3.2.1.2.電動進樣方式毛細管一端插入樣品瓶，加電壓；進樣定量參數(shù)：流體力學(xué)方式壓力和時間（mbars）,電動進樣方式電壓、電流或功率和時間,進樣量要求：樣品區(qū)帶的長度應(yīng)該小于毛細管總長度的1-2%

8、（長度相當于幾個毫米、體積相當于1-50nl）3.2.2分離系統(tǒng)毛細管:目前可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。內(nèi)徑通常為2075m,外徑為350400m，常用的有效長度為5075cm;恒溫系統(tǒng):控制柱溫變化在0.10C；高壓電源:電流0300A，電壓030KV,穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源，電壓穩(wěn)定性在0.1%。3.2.3檢測系統(tǒng)紫外-可見光檢測，二極管陣列檢測。此外，熒光，激光誘導(dǎo)熒光，質(zhì)譜等檢測方法也被應(yīng)用于毛細管電泳。4. 高效毛細管電泳應(yīng)用中存在的缺陷及改進方法4.1定量精密度較差。在用毛細管電泳做定量檢查時，所得數(shù)據(jù)的RSD值通常較大，常采用內(nèi)標法,以提高其定量精密度。如Da

9、vydova3等以氨基苯甲酸為內(nèi)標法測定小鼠尿液、血漿中的碘他拉酸鹽,結(jié)果測定低濃度碘他拉酸鹽時,5份樣品的準確度為98.0%,RSD為6.4%,測定高濃度時,準確度為99.7%,RSD為0.8%。4.2靈敏度較低。在用毛細管電泳法對樣品痕量物質(zhì)的檢查時，一方面組分濃度較小，另一方面檢測器，進樣方法的差限，導(dǎo)致靈敏度較低。隨HPCE的不斷完善,提高靈敏度的措施也愈來愈多。目前，提高毛細管電泳檢測靈敏度的措施主要有3種4：樣品的預(yù)處理采用更高靈敏度的檢測器，采用樣品濃縮技術(shù)。4.2.1樣品的前處理 樣品的前處理是提高靈敏度的重要措施，在體內(nèi)藥物分析中,常見的樣品有血漿、血清、尿液和頭發(fā)等,為避免

10、樣品中的蛋白質(zhì)和鹽等基質(zhì)對分析測定的干擾,常需對樣品進行預(yù)處理。HPCE對樣品的預(yù)處理要求,沒有HPLC和GC那么嚴格。常用的預(yù)處理方法有沉淀法和萃取法。 沉淀法中，當待測物濃度足夠大時,可離心進樣或經(jīng)簡單離心過濾后進樣。若樣品中含鹽和蛋白質(zhì),可用在柱微滲析或小孔聚丙烯酰胺凝膠將待測物與上述基質(zhì)分離。待測物分子較小且與高濃度蛋白質(zhì)混合時,可用超濾法或排阻色譜法分離。萃取法主要有液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE),這2種萃取方法都是基于待測物質(zhì)在兩相之間分配行為的差異,都適用于基質(zhì)干擾較大,待測組分數(shù)量較多,尤其是含脂溶性成分較多的樣品。也有將液-液萃取與固相萃取相結(jié)合,在消除樣本中雜質(zhì)的

11、同時,可以提高檢測靈敏度,如測定血清中R-和S-司可巴比妥5的含量就采用此法。其最低檢測限(LOD)達到1g/ml。4.2.2樣品濃縮技術(shù)的采用樣品濃縮技術(shù)是采用特殊的進樣過程將大體積樣品溶液中的痕量被測物濃縮后進行分離，從而提高檢測靈敏度的一種技術(shù),毛細管電泳中的樣品濃縮技術(shù)有柱上濃縮與柱前濃縮之分。柱上濃縮是改變毛細管電泳系統(tǒng)時進行，特大體積樣品直接引入分離色細管后，在電泳前采取適當?shù)拇胧┻M行濃縮，然后直接進電泳分離；柱前濃縮是在改變毛細管電泳系統(tǒng)時進行一般往分離毛細管前增加一段預(yù)柱，大體積樣品首先被引人預(yù)柱中采取適當措施進行濃縮，然后部分或全部被引入分離毛細管柱中進行分離。Eap等6采用

12、FASS技術(shù)對血樣中的四類抗抑郁藥物進行富集，測定了米安色(mianserin)、去米安色林、8一羥基米安色林及其對映體的血藥濃度。在進樣前以流體動力進樣法引入一小段水柱，加壓到5kV后該區(qū)場強增高，使待測物快速遷移入毛細管。在水柱和背景電解質(zhì)交界處進行富集。米安色林和去甲米安色林的LOQ為5LgL，8一羥基米安色林的LOQ為15LgL檢測快速，適用于治療藥物監(jiān)測。4.2.3采用更高靈敏度的檢測器CE常用紫外-可見檢測器，但是檢測光程受毛細管內(nèi)徑的限制,毛細管內(nèi)徑小于100um，檢測光程短，當采用一般通用型紫外檢測器時，靈敏度只能達到10-6mol/L7。常用的紫外檢測器的檢測濃度一般要求樣品

13、的進樣濃度在10-5mol/L以上，這對于純藥品的測定或?qū)嶒炇疫M行的研究來說或許不成問題,但在實際應(yīng)用中,藥品中雜質(zhì)的含量大都只在0.1%左右,濃度過低,難以達到被檢測的水平8。除紫外-可見檢測器外，近年來，CE采用了激光誘導(dǎo)熒光檢測器，它是CE中最靈敏的檢測器。另外還有質(zhì)譜檢測器，質(zhì)譜檢測器與其他檢測器相比是一種更為通用型檢測器，它的選擇性和專屬性彌補了CE中樣品遷移時間變化的不足，能給出分子量和結(jié)構(gòu)信息，使檢測具有二維性。最近我國開發(fā)的固液化學(xué)發(fā)光體系9使CE的在柱檢測靈敏度提高到10-8mol/L,并成功地應(yīng)用于分離和檢出ABEI標識的氨基酸。5. 藥物分析上的應(yīng)用藥物分析大致可分為二大

14、部分:一是原藥的定量,原藥中不純物的測定、藥劑的分析以及對它們的穩(wěn)定性的評價等以藥品質(zhì)量管理為目的的測試方法。這些方法要求有良好的選擇性,適當?shù)姆治鲮`敏度和可靠的準確度等。二是對進入人體內(nèi)的藥物或代謝物的吸收、分布、代謝、排泄等體內(nèi)動態(tài)的研究,即臨床藥物分析。這里我們主要講體內(nèi)藥物分析部分。5.1治療藥物檢測 維生素維生素是人體機能不可缺乏的一類化合物,它所包含的種類相當多,一般分為水溶性維生素和脂溶性維生素。水溶性維生素大多是以離子形態(tài)存在于溶液中,可以采用CZE法進行分離分析,如果遇到混合樣品中含有電中性的維生素試樣時,則必需選用MEKC分離方法,如煙酸以及它的代謝物具有較強的親水性,盡管

15、這一類化合物中有個別代謝物在水溶液中以中性分子存在,但它們在水中良好的溶解度可以應(yīng)用MEKC達到分離的目的11。 解熱鎮(zhèn)痛藥、抗組胺藥、消炎藥和止咳藥這些藥物常用于治療感冒頭痛。這些化合物大部分在溶液中是電中性或不溶于水,比較適合采用MEKC法,早在90年代初寺部等12對12種感冒藥成分的分離進行了研究,發(fā)現(xiàn)5種不同的直鏈烷基陰離子表面活性劑的極性功能團對分離的選擇性有很大的影響。市售的解熱鎮(zhèn)痛藥片中的無水咖啡因、撲熱息痛等用MEKC進行分離與定量,回收率接近100%,相對標準偏差低于2%13。有關(guān)這一方面的應(yīng)用報道,近幾年來逐漸增加,特別是添加有機溶劑、環(huán)糊精或混合表面活性劑使MEKC法所能

16、適用的樣品范圍得到擴大。 降壓藥以普萘洛爾為代表的降壓藥物,分子內(nèi)含有苯乙醇胺骨架,大多數(shù)的化合物呈堿性(pH10左右),所以用陽離子表面活性劑MEKC法分離這一類化合物相當適用。如用MEKC法分離測定了尿樣中10種2阻滯劑的含量14以及血清樣品中9種2阻滯劑的濃度15,尿樣測定結(jié)果的相對標準偏差在7%以內(nèi),但對血清測定結(jié)果的相對標準偏差則偏高,大部分在10%左右,最高達15.8%,這也表明對于成分越復(fù)雜的樣品,測定結(jié)果的誤差可能性越大,在這一點上,CE與其它方法是相同的?？股?、合成抗菌劑抗生素、合成抗菌劑大多以離子形態(tài)存在于溶液中,適用于CZE法。如用0.15mol/L硼酸作為電泳液(pH

17、9.4)對硫酸慶大霉素進行分離與定量16,針劑中的3種有效成分的移動時間的相對標準偏差為5%,定量結(jié)果的相對標準偏差為2.1%3.6%,與微生物定量法的結(jié)果一致。另外,頭孢拉定以及所含的主要雜質(zhì)頭孢氨芐的分析,采用MEKC法可以得到良好的分離17,比較了9批頭孢拉定沖劑的HPLC和MEKC分析結(jié)果,兩組的數(shù)據(jù)非常相近,測定結(jié)果的相對差值在-1.66%0.22%之間。5. 2濫用藥物將HPCE用于濫用藥物分析,在毒品檢驗、戒毒工作方面有獨特的優(yōu)勢。有些吸毒者雖然在短期內(nèi)停止吸毒,在尿樣或血清中檢測不出毒品,但對于它們頭發(fā)中痕量18可卡因、嗎啡仍可用CZE檢測出,以確定其有無吸毒史?！緟⒖嘉墨I】1

18、羅國安，王望明.毛細管電泳在臨床檢驗中的應(yīng)用J中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1996，19(5):822牛其云，徐冰.高效毛細管電泳及其在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用J.實用醫(yī)技雜志，2005,12(6):1441-1443.3牛其云，徐冰.高效毛細管電泳及其在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用J.實用醫(yī)技雜志，2005,12(6):1441-1443.4史愛欣，李可欣，曹國穎，等高效毛細管電泳法測定班布特羅及其代謝物特布他林的血藥濃度J藥物分析雜志，2001，21(4)：2915李朵璐，闞全程大鼠體內(nèi)左氧氟沙星對多索茶堿藥代動力學(xué)的影響J中國藥業(yè)，2004，13(1)：426余麗寧，李發(fā)美大鼠血漿中馬來酸曲美布汀的HPCE測定法及藥物動力學(xué)J.藥學(xué)學(xué)報,2001,36(2):1317劉會臣,于洋,王娜,等.反式曲馬朵和反式氧去甲基曲馬朵在大鼠膽汁中排泄的立體選擇性J藥學(xué)學(xué)報，2003，38(6)：4128李曉海，張金蘭，周同惠葉荻堿的高效毛細管電泳手性分離及其大鼠體內(nèi)立體選擇性代謝研究J藥學(xué)學(xué)報，2002，37(1)：509張慧文，何麗明.高效毛細管電泳法在體內(nèi)藥物分析的應(yīng)用J.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(8):1132-1136.10ZhangCX，AcbiY，ThormannWMicroassayofamiodaroneanddesethylamiodaroneinserumbyc