WB免疫印跡實驗常見問題全匯總

1、【干貨收藏貼】WB常見問題精品全集錦做了很久的WB（western blot），走了很多彎路，但是WB想要做好并不難，總結(jié)WB實驗中可能會遇到的問題，分析可能的原因及對應(yīng)的解決方案，這就是實驗成功的基石。以下，我們先解決很多技術(shù)菌的疑惑，然后再著手匯總實驗中常見問題和可能原因分析以及給出建議解決方案。WB常見問題分析1.為什么我的細(xì)胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？原因有很多：a) 細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；b) 細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性；c) 抗體不能識別目標(biāo)蛋白，多看看說明，是否有問題；d) 酶降解可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當(dāng)，樣品放置時間

2、過長。2.我做的蛋白質(zhì)分子量很?。?0KDa），請問怎么做WB？a)可以選擇PSQ 膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可；b)也可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系。3.我的目的帶很弱，如何加強(qiáng)？a)可以加大抗原上樣量，這是最主要的；b)也可以將一抗稀釋比例降低；c)還可以延長曝光時間。4.DAB好還是ECL好？DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECL結(jié)果容易控制，但被催化時靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。5.膠片是一片空白，是怎么回事？如果能

3、夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；c) ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；d)一抗選擇不當(dāng)二抗失活；e)二抗失活。6.磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。7.細(xì)胞水平要做WB，多少細(xì)胞提的蛋白夠做WB？一般5106就足夠。8.如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以

4、考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。9.大分子量蛋白200KDa，在做WB要注意什么？a)做200kd蛋白的WB時要注意，分離膠最好選擇7%的；剝膠時要小心；b)轉(zhuǎn)移時間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。c)轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當(dāng)降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高哦!10.免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那

5、么這種抗體可同時用于免疫組化和WB，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。11.WB中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？抗體工作溶液一般不主張儲存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用23次。稀釋后應(yīng)在23天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。12.上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果？無特殊要求。但一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩次的緩沖液。WB 實驗中常會出現(xiàn)各種問題，也跟技術(shù)菌們一起分享下 WB 實驗中各種問題及應(yīng)用對策，希望給您的實驗帶來實實在在的幫助WB問題匯總及解決建議問題原因解決方案條帶形狀不好看膠凝的不均勻，聚合不好灌膠前將溶液充分混勻某些樣品鹽濃度較高除鹽或

6、將樣品鹽濃度調(diào)成一致緩沖液陳舊，成分改變重配凝膠下面有氣泡電泳前先將氣泡趕走電泳時溫度過高降低電流或電壓樣品中含有不溶性顆粒樣品充分?jǐn)嚢杌靹螂姌O不平衡或者加樣位置偏斜調(diào)整電極和加樣蛋白條帶信號弱樣品上樣量不足或目的蛋白濃度過低加大上樣量或濃縮樣品轉(zhuǎn)移不完全或過轉(zhuǎn)移可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時間和電流抗體濃度低增加抗體濃度或延長孵育時間封閉過度減少封閉劑的量或縮短時間，換用不同封閉劑類型顯色劑失效更換顯色劑（吸取A、B液的槍頭不可混用）顯色或曝光時間不足延長顯色或曝光時間HRP 抑制劑所用溶液和容器內(nèi)避免含有疊氮化鈉轉(zhuǎn)膜效率低轉(zhuǎn)膜緩沖

7、液pH值與目的蛋白等電點(diǎn)相近提高轉(zhuǎn)膜緩沖液pH值凝膠與膜之間存在氣泡轉(zhuǎn)膜前要排盡氣泡轉(zhuǎn)印膜種類選擇不當(dāng)使用質(zhì)量可靠的PVDF膜或硝酸纖維素膜電壓或電流過小濕轉(zhuǎn)時20mA恒流，半干轉(zhuǎn)時25V左右恒壓轉(zhuǎn)印時間過長或過短根據(jù)蛋白大小及轉(zhuǎn)印裝置選擇合適的轉(zhuǎn)印時間濕轉(zhuǎn)過程中環(huán)境溫度過高使用預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液或?qū)⒀b置至于4度顯色或曝光后無條帶選用的一抗、二抗及顯色方法不合適選擇合適的一抗、二抗和顯色方法目的蛋白含量低于檢測下限加大上樣量或濃縮樣品抗體效價過低增加抗體濃度抗體孵育時間不足延長孵育時間，37C孵育1小時以上抗體過度洗滌減少洗滌時間及次數(shù)，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多加入HRP底物反應(yīng)與曝光檢測之間

8、間隔時間過長反應(yīng)3到5分鐘及時檢測背景高膜沒有完全均勻濕透使用100% methanol浸透膜洗膜不充分增加洗液體積和洗滌次數(shù)封閉物用量不足提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜封閉物使用不當(dāng)檢測生物素標(biāo)記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉封閉時間不夠室溫37度封閉1小時以上，4度封閉過夜抗體非特異性結(jié)合降低抗體濃度，減少孵育時間一抗稀釋度不適宜對抗體進(jìn)行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度一抗孵育的溫度偏高建議4結(jié)合過夜抗體濃度過高或洗滌不夠降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時間化學(xué)顯色底物過多按說明書加入適量的顯色底物蛋白條帶位置 （大?。┎粚ο鄬﹄姾砂被犭姾傻慕M成膠濃度不同濃度的膠跑出的蛋白條帶

9、的位置可能有所偏差，調(diào)整濃度抗體孵育不充分增加抗體濃度，延長孵育時間酶失活直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體查詢相關(guān)文獻(xiàn)確定標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低設(shè)置陽性對照比對結(jié)果，增加標(biāo)本上樣量雜帶多目的蛋白有多個修飾位點(diǎn)，本身可以呈現(xiàn)多條帶查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實際大小樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作雜蛋白多處理目的蛋白抗體特異性不強(qiáng)使用特異性強(qiáng)的抗體抗體孵育時間過久減少抗體孵育時間二抗與抗原有交叉反應(yīng)選擇合適的封閉物二聚體或多聚體存在增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度底物顯色與曝光時間過長縮短顯色及曝光的時間大分子量WB膜孔徑太小更換孔徑較大的膜轉(zhuǎn)膜電壓電流低提高電壓/電流轉(zhuǎn)膜時間短延長轉(zhuǎn)膜時間膠濃度太大使用低濃