課題2　土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù).ppt

1、課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù),專題2 微生物的實驗室培養(yǎng),尿素CO(NH2)2重要的農(nóng)業(yè)氮肥。 只有被土壤中細(xì)菌分解為NH3才能被植物吸收利用,CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3,一.關(guān)于尿素背景,(一)篩選菌種,1、 實例：尋找耐高溫的DNA聚合酶,啟示：,PCR技術(shù)：要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。,尋找目的菌種時要根據(jù)它對_，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,生存環(huán)境的要求,耐高溫的酶,耐高溫生物體,耐高溫環(huán)境（熱泉、火山口）,尋找,尋找,Taq細(xì)菌,篩選原因: 因為熱泉的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物， 使耐熱的Taq細(xì)菌保留下來。,二.研究思路,人為提供有利于

2、目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。,思考： 該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？,碳源：葡萄糖,氮源：尿素,2、實驗室中微生物的篩選原理,此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌？為什么？,原則上能。只有產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌能利用尿素作為氮源而生存。,3 、選擇培養(yǎng)基：,在微生物學(xué)中，將允許_，同時_生長的培養(yǎng)基。,特定種類的微生物生長,抑制或阻止其他種類微生物,一句話說出能選擇分解尿素的細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基成分特點？,以尿素作為培養(yǎng)基中唯一的氮源,上節(jié)課提到的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以選擇出分解尿素的細(xì)菌嗎？,不能,無尿素有其他氮源,牛肉膏蛋白胨

3、培養(yǎng)基在這里有沒有作用？,1、 顯微鏡直接計數(shù)：,利用血球計數(shù)板(血細(xì)胞計數(shù)板），在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量,這種方法還需要把微生物培養(yǎng)成菌落嗎？,對樣品中細(xì)菌計數(shù)方法,2 稀釋涂布平板法（間接計數(shù)）,101,102,103,104,105,106,方法 運用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計樣品中的活菌數(shù)。,原理 1個活菌（不可見）1個菌落（可見）,計算方法,(二)統(tǒng)計菌落數(shù)目,每克樣品中的菌株數(shù) =（CV）M,某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106 的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234個，那么每克樣品中的菌株數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.

4、34109 C. 234 D. 23.4,B,看課本P22，并討論你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？,第一位同學(xué)：沒有重復(fù)實驗（至少涂布3個平板） 第二位同學(xué)：A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值,選擇菌落數(shù)在30300的平板上計數(shù),要點：,需培養(yǎng)計算出三個或三個以上的平板菌落求平均數(shù),統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低,統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)（而非菌株數(shù)）來表示,閱讀P2223頁“（三）設(shè)置對照”一段討論教材中提出的問題。,設(shè)置對照的目的：,排除實驗組中非測試因素對試驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。,(1)A同學(xué)出現(xiàn)此結(jié)果的可能原因？,土樣不同 培養(yǎng)基污染 (或混入了其他的含

5、氮物質(zhì)),(三)設(shè)置對照,(2)設(shè)置對照實驗，幫助A同學(xué)排除上述兩個可能影響實驗結(jié)果的因素？,這個實例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少,方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實驗,方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明_；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在_ _,A無誤,培養(yǎng)基的配,制有問題。,如果其他同學(xué)不配合，想看笑話，A同學(xué)只能選擇哪種方案自證清白？,方案2,實驗流程：,3、樣品稀釋涂布平板,4、微生物的培養(yǎng)與觀察,5、菌落計數(shù),1、土壤取樣,2、制備培養(yǎng)基,三.實驗設(shè)計,1

6、、土壤取樣,從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。,“微生物的天然培養(yǎng)基”,數(shù)量最大、種類最多,大約70%90%是細(xì)菌,1、土壤取樣,2、制備培養(yǎng)基,制備選擇培養(yǎng)基（尿素為唯一氮源） 制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。,（對照作用）,思考？為什么還要制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基？,3、樣品稀釋涂布平板,1、土壤取樣,2、制備培養(yǎng)基,稀釋倍數(shù)為 101 106。每個稀釋度均用3個選擇培養(yǎng)基和1個牛

7、肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基（對照）,3、樣品稀釋涂布平板,1、土壤取樣,2、制備培養(yǎng)基,4、微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,不同種類的細(xì)菌形成的菌落，在大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作為菌種鑒定的重要依據(jù)。,一無菌操作 1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。 2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好標(biāo)記 注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。 三制定計劃,四.操作提示,1.培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落？,對照的培養(yǎng)皿無菌落說明培養(yǎng)基沒有污染。 牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目多余選擇培養(yǎng)基的菌落數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。,五.結(jié)果分析與評價,2.獲得某一稀釋度下，菌落數(shù)30300的平板，在這以稀釋度下是否至少有兩個平板的菌落數(shù)相接近？,相接近，說明操作成功。,1.在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)