甘肅省武威市高中生物第5章DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)5.2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)課件【新人教版】.pptx

1、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR,一、實(shí)驗(yàn)原理：,PCR又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外酶促合成特異DNA片段的方法，主要由 高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成：即在高溫下， 待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫情況下，兩 條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在 Taq酶的最適溫度（72）下，以引物3端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原 料，Mg2+存在下，沿模板以53方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈 的DNA模板，經(jīng)過(guò)一次解鏈、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈 DNA分子。如此反復(fù)進(jìn)行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下

2、一次循環(huán)的模 板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍， PCR產(chǎn)物得以指數(shù)形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)2530個(gè)循環(huán)后，理論上可使基因 擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍。,DNA模板：反應(yīng)中DNA量在50ng200ng左右。且DNA純度較 高， 以增加反應(yīng)特異性。 dNTP:反應(yīng)體系中達(dá)100M200M。 Mg2+：Mg2+是Taq酶的輔基濃度在2.0mM左右，濃度太低 Taq酶活力降低；太高反應(yīng)特異性降低。 引物：根據(jù)目的基因兩側(cè)特定序列設(shè)計(jì)。引物約20堿基 左右；G+C含量在4070之間；引物內(nèi)部不能有回該 序列；引物端不能互補(bǔ)。 Taq酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性聚合酶，在95時(shí)30分

3、鐘還有50活力。,說(shuō)明,PCR過(guò)程示意圖,二、實(shí)驗(yàn)所需器材和試劑 器材： 臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫水浴鍋，PCR擴(kuò)增儀，瓊脂糖 凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，Eppendorf離心管， PCR小管,試劑： 引物1，引物2，dNTP mix，10X PCR Buffer， Taq DNA 聚合酶，EB，上樣緩沖液，marker，瓊 脂糖，TBE緩沖液,三、實(shí)驗(yàn)步驟,1：加樣 按次序在PCR小管中加入下列試劑（50ul體系）： 5ul 10X PCR Buffer 4ul dNTP mix 2ul 引物1 2ul 引物2 3ul 模板 1ul Taq DNA polymerase 加水到總體積50ul,注意事項(xiàng)：同時(shí)設(shè)立對(duì)照組（對(duì)照組不加模板DNA）,2、按以下參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（對(duì)于不同的PCR反應(yīng)應(yīng)設(shè)置不同的反應(yīng)條件） 94 4分鐘 94 30秒 51 30秒 進(jìn)行30個(gè)循環(huán) 72 30秒 72 5分鐘 4,將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組放入PCR儀，按設(shè)定好的條件進(jìn)行擴(kuò)增,3、擴(kuò)增結(jié)束后，取5ul產(chǎn)物進(jìn)行