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文檔簡介

1、多聚酶鏈式反應PCR,一、實驗原理：,PCR又稱多聚酶鏈式反應，是一種體外酶促合成特異DNA片段的方法，主要由 高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環(huán)構成：即在高溫下， 待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫情況下，兩 條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；在 Taq酶的最適溫度（72）下，以引物3端為合成的起點，以單核苷酸為原 料，Mg2+存在下，沿模板以53方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈 的DNA模板，經過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈 DNA分子。如此反復進行，每一次循環(huán)所產生的DNA均能成為下

2、一次循環(huán)的模 板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數擴增一倍， PCR產物得以指數形式迅速擴增，經過2530個循環(huán)后，理論上可使基因 擴增數百萬倍。,DNA模板：反應中DNA量在50ng200ng左右。且DNA純度較 高， 以增加反應特異性。 dNTP:反應體系中達100M200M。 Mg2+：Mg2+是Taq酶的輔基濃度在2.0mM左右，濃度太低 Taq酶活力降低；太高反應特異性降低。 引物：根據目的基因兩側特定序列設計。引物約20堿基 左右；G+C含量在4070之間；引物內部不能有回該 序列；引物端不能互補。 Taq酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性聚合酶，在95時30分

3、鐘還有50活力。,說明,PCR過程示意圖,二、實驗所需器材和試劑 器材： 臺式高速離心機，恒溫水浴鍋，PCR擴增儀，瓊脂糖 凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，Eppendorf離心管， PCR小管,試劑： 引物1，引物2，dNTP mix，10X PCR Buffer， Taq DNA 聚合酶，EB，上樣緩沖液，marker，瓊 脂糖，TBE緩沖液,三、實驗步驟,1：加樣 按次序在PCR小管中加入下列試劑（50ul體系）： 5ul 10X PCR Buffer 4ul dNTP mix 2ul 引物1 2ul 引物2 3ul 模板 1ul Taq DNA polymerase 加水到總體積50ul,注意事項：同時設立對照組（對照組不加模板DNA）,2、按以下參數進行PCR擴增（對于不同的PCR反應應設置不同的反應條件） 94 4分鐘 94 30秒 51 30秒 進行30個循環(huán) 72 30秒 72 5分鐘 4,將實驗組與對照組放入PCR儀，按設定好的條件進行擴增,3、擴增結束后，取5ul產物進行

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