[醫(yī)學]微生物學教案第八章微生物遺傳

1、精選文檔第八章微生物遺傳第一節(jié) 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)還是核酸，曾是生物學中激烈爭論的重大問題之一。1944年Avery等人以微生物為研究對象進行的實驗，無可辨駁地證 實遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)不是蛋白質(zhì)而是核酸，并且隨著對DNA特性(結(jié)構(gòu)的多樣性，自體復制特性等)的了解，“核酸是遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)”這一生物學中的重大理論才真正得以突破。下面分別介紹以DNA和RNA為遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的微生物學實驗證據(jù)。一 DNA作為遺傳物質(zhì)1.Griffith的轉(zhuǎn)化實驗1928年英國的一位細菌學家F.Griffith將能使小鼠致死的S型菌株加熱殺死，并注入小鼠體內(nèi)后，小鼠不死，而且也不能從小鼠體內(nèi)重新分離到肺炎球

2、菌。但是當他們進一步將加熱殺死，已無致病性的S菌和小量活的非致病的R型菌(由S型突變而來)一起注入小鼠體內(nèi)后，意外地發(fā)現(xiàn)小鼠死了， 而且從死的小鼠中分離到活的S型菌株(注意不是S型)。顯然，小鼠致死的原因正是由于這些S型菌的毒性作用，那么這些S菌從何而來呢?實驗不難證明注入小鼠體內(nèi)的S菌已全部被殺死，因此不可能是S的殘留者，同時，也不可能是R型回復突變所致，因為來自S型的R型的回復突變應為S型而不是S型。唯一合理的解釋是：活的、非致病性的R型從 已被殺死的S型中獲得了遺傳物質(zhì)，使其產(chǎn)生莢膜成為致病性的S型。Griffith將這種現(xiàn) 象稱為轉(zhuǎn)化(transformation)。幾年后，這一現(xiàn)象在

3、離體條件下進一步得到證實，并將引起轉(zhuǎn)化的遺傳物質(zhì)稱為轉(zhuǎn)化因子(transforming factor)。Griffith是第一個發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的 ，雖然當時還不知道稱之為轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)是什么，但是他的工作為后來Avery等人進一步 揭示轉(zhuǎn)化因子的實質(zhì)，確立DNA為遺傳物質(zhì)奠定了重要基礎(chǔ)。2.DNA作為遺傳物質(zhì)的第一個實驗證據(jù)Avery和他的合作者C.M.Macleod和M.J.McCarty為了弄清楚Griffith實驗中的轉(zhuǎn)化因子的實質(zhì)，他們分別用降解DNA、RNA或蛋白質(zhì)的酶作用于有毒的S型細胞抽提物，選擇性地破壞這些細胞成份，然后分別與無毒的R型細胞混合，觀察轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的發(fā)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有

4、DNA被酶解而遭到破壞的抽提物無轉(zhuǎn)化作用，說明DNA是轉(zhuǎn)化所必須的轉(zhuǎn)化因子，并在1944 年發(fā)表了他們的實驗結(jié)果，為Griffith的轉(zhuǎn)化因子是DNA而不是蛋白質(zhì)提供了第一證據(jù)。為了消除“蛋白質(zhì)論”者的懷疑，Avery等人將DNA抽提出來，進行不斷的純化，直到1949年，作為轉(zhuǎn)化因子的DNA已純化到所含蛋白質(zhì)只有0.02%，這時的轉(zhuǎn)化效果非但不減少反而增加，并隨DNA濃度的增加而增加。DNA作為遺傳信息的載體已充分獲得證實。3.T2噬菌體的感染實驗1952年，Alfred D.Hershey和Martha Chase為了證實T2噬菌體的DNA是遺傳物質(zhì)，他們用P32標記病毒的DNA，用S35標

5、記病毒的蛋白質(zhì)外殼。然后將這兩種不同標記的 病毒分別與其宿主大腸桿菌混合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用含有S35蛋白質(zhì)的T2噬菌體感染大腸桿菌時，大多數(shù)放射活性留在宿主細胞的外邊，而用含有P32DNA的T2噬菌體與宿 主細菌混合時，則發(fā)現(xiàn)P32DNA注入宿主細胞，并產(chǎn)生噬菌體后代，這些T2噬菌體后代的蛋白質(zhì)外殼的組成、形狀大小等特性均與留在細胞外的蛋白質(zhì)外殼一模一樣，說明決定蛋白質(zhì)外殼的遺傳信息是在DNA上，DNA攜帶有T2的全部遺傳信息(圖8-1)。 圖8-1 T2噬菌體的實驗二、RNA作為遺傳物質(zhì)有些生物只由RNA和蛋白質(zhì)組成，例如某些動物和植物病毒以及某些噬菌體(見第七章)。1956年，H.Fraenk

6、elConrat用含RNA的煙草花葉病毒(Tobacco Mosaic Virus，簡稱TMV) 所進行的拆分與重建實驗證明RNA也是遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)。圖8-2顯示其實驗的過程：(1)用表面活性劑處理標準TMV，得到它的蛋白質(zhì)；(2)從TMV的變種HR(外殼蛋白的氨基酸組成與標準株存在2-3個氨基酸的差別)通過弱堿處理得到它的RNA；(3)通過重建獲得雜種病毒；(4)標準TMV抗血清使雜種病毒失活，HR抗血清不使它失活，證實雜種病毒的蛋白質(zhì)外殼是來自TMV標準株。(5)雜種病毒感染煙草產(chǎn)生HR所特有的病斑，說明雜種病毒的感染特性是由HR的RNA 所決定，而不是二者的融合特征；(6)從病斑中一再分

7、離得到的子病毒的蛋白質(zhì)外殼是HR蛋白質(zhì)，而不是標準株的蛋白質(zhì)外殼。以上實驗結(jié)果說明雜種病毒的感染特征和蛋白質(zhì)的特性 是由它的RNA所決定，而不是由蛋白質(zhì)所決定，遺傳物質(zhì)是RNA。 圖8-2 TMV病毒拆分重建實驗三、朊病毒的發(fā)現(xiàn)和思考無論是DNA還是RNA作為遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)已是無可辨駁的事實。但朊病毒(prion)的發(fā)現(xiàn)對“ 蛋白質(zhì)不是遺傳物質(zhì)”的定論也帶來一些疑云。prpsc(見第七章)是具有傳染性的蛋 白質(zhì)致病因子，迄今未發(fā)現(xiàn)該蛋白內(nèi)有核酸。但已知的傳染性疾病的傳播因子必須含有核酸 (DNA或RNA)組成的遺傳物質(zhì)，才能感染宿主并在宿主體內(nèi)自然繁殖。那么這是生命界的又一特例呢? 還是因為目

8、前人們的認識和技術(shù)所限而尚未揭示的生命之謎呢? (如有人堅持認為prpsc中可能含有極微量的核酸)還有待生命科學家去認識和探索。但prpsc的致病性是由于prpc改變折疊狀態(tài)所致，這一廣為證實的事實，已是當今分子生物學研究的熱點之一由蛋白質(zhì)的折疊與生物功能之間的關(guān)系的研究延伸至與疾病的致病因子之間的關(guān)系的研究，為治療和根除prpsc引起的疾病(有人稱為構(gòu)象病)開辟新的途徑。 “第二遺傳密碼”“折疊密碼”?1958年，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的奠基人之一，英國科學家Crick以DNARNA蛋白質(zhì)(或多肽鏈)的單向傳遞形式，首次提出遺傳信息傳遞的中心法則。三聯(lián)密碼將使RNA(mRNA)中的 核苷酸序列

9、轉(zhuǎn)變成新生肽鏈中的氨基酸序列?，F(xiàn)已知道，新生肽鏈必須經(jīng)過一系列極其復雜 的加工和成熟過程，形成特定空間結(jié)構(gòu)后才能成為有活性的蛋白質(zhì)，這個過程包括氨基 酸殘基的化學修飾和正確、適時的折疊。60年代，Anfinsen曾提出蛋白質(zhì)的氨基酸 序列已經(jīng)包含了它的三維結(jié)構(gòu)的全部信息，或一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)，但是一級結(jié)構(gòu)到底如 何決定高級結(jié)構(gòu)的呢?如果說三聯(lián)密碼，即三個堿基決定一個氨基酸是“遺傳密碼”，那么多肽鏈中氨基酸序列如何決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是否也存在另一套密碼“折疊密碼”呢 ?“折疊密碼”的翻譯過程又是怎樣的呢?中心法則是否應表述為：DNARNA多肽鏈蛋白質(zhì)呢?這是現(xiàn)代分子生物學研究中尚未解決的核心

10、問題之一。第二節(jié) 微生物的基因組結(jié)構(gòu)基因組(genome)是指存在于細胞或病毒中的所有基因。細菌在一般情況下是一套基因，即單倍體(hoploid)；真核微生物通常是有二套基因又稱二倍體(diploid)?；蚪M通常是指全部一套基因。由于現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)許多非編碼序列具有重要的功能，因此目前基因組的含義實際上是指細胞中基因以及非基因的DNA序列組成的總稱，包括編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控序列以及目前功能還尚不清楚的DNA序列。但無論是原核還是真核微生物，其基因組一 般都比較小(表8-1)，其中最小的大腸桿菌噬菌體MS2只有3000bp，含3個基因。一般來說這些依賴于宿主生活的病毒基因組都很小。近年來對微生

11、物基因組序列的測定表明，能進行獨立生活的最小基因組是一種生殖道枝原體，只含473個基因，通過與流感嗜血菌序列比較研究，提出了256個基因可能是維持細胞生命活動所必需的最低數(shù)量的假說。微生物基因組隨不同類型(真細菌、古生菌、真核微生物)表現(xiàn)出多樣性，下面分別以大腸桿菌、詹氏甲烷球菌和啤酒酵母為代表說明。表8-1 微生物與幾種代表生物的基因組生物基因數(shù)基組大小(bp)MS2噬菌體(MS2 Phage)33103 噬菌體( Phage)505104T40噬菌體(T4 Phage)1502105 生殖道枝原體(Mycoplasma genitalium)4730.58106詹氏甲烷球菌(Methano

12、coccus jannaschii)*16821.66106幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)1.66106 嗜熱堿甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)1.25 106 流感嗜血菌(Hacmophilus influenzae)17601.83106閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)2.18106枯草桿菌(Bacillus subtilis)37004.2106大腸桿菌(Escherichia coli)41004.7106黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)80009.4106啤酒酵母(

13、Saccharomyces cerevisiae)580013.5106脈孢菌屬(Neurospora)500060106果蠅(Drosophila melanogaster)12000165106Mus musculus(一種脊索動物)700003300106Nicotiana tobacum(一種煙草)430004500106擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)160003300070-145106人(human)50000-10000030109 *表示古生菌一、大腸桿菌的基因組大腸桿菌基因組為雙鏈環(huán)狀的DNA分子*，在細 胞中以緊密纏繞成的較致密的不規(guī)則小體形式存在于細

14、胞中，該小體稱為擬核(nucliod)， 其上結(jié)合有類組蛋白蛋白質(zhì)和少量RNA分子，使其壓縮成一種手腳架形的(scaffold)致密結(jié) 構(gòu)(大腸桿菌DNA分子長度是其菌體長度的1000倍，所以必須以一定的形式壓縮進細胞中) 。大腸桿菌及其它原核細胞就是以這種擬核形式在細胞中執(zhí)行著諸如復制、重組、轉(zhuǎn)錄、 翻譯以及復雜的調(diào)節(jié)過程?；蚪M全序列測定于1997年由Wisconsin大學的Blattner等人完成，其基因組結(jié)構(gòu)特點如下：1.遺傳信息的連續(xù)性從表8-1可以看出，大腸桿菌和其它原核生物中基因數(shù)基本接近由它 的基因組大小所估計的基因數(shù)(通常以1000bp1500bp為一個基因計，說明這些微生物

15、基因 組DNA 絕大部分用來編碼蛋白質(zhì)、RNA；用作為復制起點、啟動子、終止子和一些由調(diào)節(jié)蛋白識別 和結(jié)合的位點等信號序列。除在個別細菌(鼠傷寒沙門氏菌和犬螺桿菌)和古生菌的rRNA和tR NA中發(fā)現(xiàn)有內(nèi)含子或間插序列外，其它絕大部分原核生物不含內(nèi)含子，遺傳信息是連續(xù)的而不是中斷的。 2.功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成操縱子結(jié)構(gòu)大腸桿菌總共有2584個操縱子，基因組測序推測出2192個操縱子。其中73%只含一個基因，16.6%含有2個基因，4.6%含有3個基因，6%含有4個或4個以上的基因。大腸桿菌有如此多的操縱子結(jié)構(gòu)，可能與原核基因表達多采用轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)，因為組成操縱子有其方便的一面。此外有些功能相

16、關(guān)的RNA基因也串聯(lián)在一起，如構(gòu)成核糖核蛋白體的三種RNA基因轉(zhuǎn)錄在同一個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，它們依次是16SrRNA23SrRNA5SrRNA。這三種RNA除了組建核糖體外，別無他用，而在核糖體中的比例又是111，倘若它們不在同一個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，則或者造成 這三種RNA比例失調(diào)，影響細胞功能；或者造成浪費；或者需要一個極其復雜、耗費巨大的調(diào)節(jié)機構(gòu)來保持正常的111。3.結(jié)構(gòu)基因的單拷貝及rRNA基因的多拷貝在大多數(shù)情況下結(jié)構(gòu)基因在基因組中是單拷貝的，但是編碼rRNA的基因rrn往往是多拷貝的，大腸桿菌有7個rRNA操縱子，其特征都與基因組的復制方向有關(guān)，即按復制方向表達。7個rrn操縱子中就有6個分布

17、在大腸桿菌DNA的雙向復制起點oric(83分鐘處)附近，而不是在復制終點(33分鐘)附近，可以設想，在一個細胞周期中，復制起點處的基因的表達量幾乎相當于處于復制終點的同樣基因 的兩倍，有利于核糖體的快速組裝，便于在急需蛋白質(zhì)合成時，細胞可以在短時間內(nèi)有大量核糖體生成。大腸桿菌及其它原核生物(如枯草桿菌的rrn有10個拷貝)rrn多拷貝及結(jié)構(gòu)基因的單拷貝，也反映了它們基因組經(jīng)濟而有效的結(jié)構(gòu)。 4.基因組的重復序列少而短原核生物基因組存在一定數(shù)量的重復序列，但比真核生物少得多，而且重復的序列比較短，一般為440個堿基，重復的程度有的是十多次，有的可達上千次*。 *典型的原核生物染色體是環(huán)狀DNA

18、分子，但發(fā)現(xiàn)布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)的染色體是線狀的。*流感嗜血菌基因組上有1465個“攝取位點”的重復，其重復序列為5-AAGTGCGGTCA-3。二、啤酒酵母的基因組啤酒酵母是單細胞真核生物，1996年，由歐洲、美國、加拿大和日本共96個實驗室的633位科學家的艱苦努力完成了全基因組的測序工作，這是第一個完成測序的真核生物基因組。該基因大小為13.5106bp，分布在16個不連續(xù)的染色體中(表8-2)。象所有其它的真核細胞 一樣，酵母菌的DNA也是與四種主要的組蛋白(H2A、H2B、H3和H4)結(jié)合構(gòu)成染色質(zhì)(chromatin)的14bp核小體核心DNA；

19、染色體DNA上有著絲粒(centromere)和端粒(telomere)，沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu)，有間隔區(qū)或內(nèi)含子序列。酵母菌基因組最顯著的特點是高度重復， 從表8-2可看出tRNA基因在每個染色體上至少是4個，多則30多個，總共約有250個拷貝(大腸 桿菌約60個拷貝)。rRNA基因只位于號染色體的近端粒處，每個長9137bp，有100200個拷貝。酵母基因組全序列測定完成后，在其基因組上還發(fā)現(xiàn)了許多較高同源性的DNA重復序 列，并稱之為遺傳豐余(genetic redundancy)。酵母基因組的高度重復或遺傳豐余是一種浪費和多余呢?還是一種進化的策略呢?顯然應該是后者，所有現(xiàn)存的生物在自然

20、的不斷選擇下 ，總是以合適的結(jié)構(gòu)特征來完成其生命過程。也許是在份數(shù)這么多的豐余基因中，如果有少數(shù)基因突變而失去功能的話，可不影響生命的生存；也許是為了適應復雜多變的環(huán)境，多余的基因可使生物體能夠在不同的環(huán)境中分別使用多個功能相同或者相似的基因產(chǎn)物，做到有備無患。因此從這個意義上講酵母確實比細菌和病毒“進步”且“富有”，而細菌和病毒( 許多病毒基因組上的基因是重疊的)似乎更“聰明”，知道如何盡量經(jīng)濟和有效地利用其有限的遺傳資源。表8-2 啤酒酵母的染色體染色體長度(kbp)基因數(shù)tRNA基因數(shù)2301064813423133151721015328142757729213270136101091

21、573335632911143923110 74538724666334161078550229244872178442115109257120 94849917 注：號染色體長度只包括了二個拷貝rDNA，實際上有100-200個，長1-2106bp。三、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的基因組詹氏甲烷球菌屬于古生菌，該菌發(fā)現(xiàn)于1982年。生活在2600m深，260個大氣壓，94的海底火山口附近。1996年由美國基因組研究所(The Institute for Genomic Research，簡稱TIG R)和其它5個單位共40人聯(lián)合完成了該菌的基因組全測序工

22、作。這是完成的第一個古生菌和自養(yǎng)型生物的基因組序列。根據(jù)對該菌全基因組序列分析結(jié)果完全證實了1977年由Woese等人提出的三界學說。因此有人稱之為“里程碑”的研究成果。從目前已知的詹氏甲烷球菌和其它古生菌的基因組全序列分析結(jié)果來看，幾乎有一半的基因通過同源搜索在現(xiàn)有的基因數(shù)據(jù)庫中找不到同源序列。例如詹氏甲烷球菌只有40%左右的基因與其它二界生物有同源性，其中有的類似于真細菌，有的則類似于真核生物，有的就是二者融合。可以說古生菌是真細菌和真核生物特征的一種奇異的結(jié)合體。一般而言，古生菌的基因組在結(jié)構(gòu)上類似于細菌。例如：詹氏甲烷球菌有一個大小為1.66106bp的環(huán)形染色體DNA，具有1682個

23、編碼蛋白質(zhì)ORF；功能相關(guān)的基因組成操縱子結(jié)構(gòu)，共轉(zhuǎn)錄成一個多順反子轉(zhuǎn)錄子；有2個rRNA操縱子；有37個tRNA基因，基本上無內(nèi)含子；無核膜等。但是負責信息傳遞功能的基因(復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯)則類似于真核生物，特別是古生菌的轉(zhuǎn)錄起始系統(tǒng)基本上與真核生物一樣，而與細菌的截然不同。古生菌的RNA聚合酶在亞基組成和亞基序列上類同于真核生物的RNA聚合酶和，而不同于真細菌的RNA聚合酶。與之相應的是啟動子結(jié)構(gòu)也類同于真核生物，TATAbox序列都位于轉(zhuǎn)錄起始點上游25-30核苷酸處，這與細菌啟動子的典型結(jié)構(gòu)(-10和-35)相悖。古生菌的翻譯延伸因子EF-Ia(細菌中是EF-Tu)和EF-2(細菌中是

24、EF-G)，氨酰tRNA合成酶基因，復制起始因子等均與真核生物相似。此外，古生菌還有5個 組蛋白基因，其產(chǎn)物組蛋白的存在可能暗示：雖然甲烷球菌基因圖譜看上去酷似細菌，但基因組本身在細胞內(nèi)可能實際上是按典型的真核生物樣式組織成真正的染色體結(jié)構(gòu)。同時具有細菌和真核生物基因組結(jié)構(gòu)特征的古生菌對研究生命的起源和進化無疑是十分重要的，而許多古生菌特有的基因(目前還未搜索到與其它二界生物同源的基因)也正吸引著越來 越多的科學家去研究和探索，這些特有的基因也許為許多新奇的蛋白質(zhì)編碼，這將為開發(fā)新的藥物，生物活性物質(zhì)或在工業(yè)中實施新的技術(shù)開拓廣闊的前景。微生物向鄰居“借”或“盜用”基因*微生物通過接合、轉(zhuǎn)導和

25、轉(zhuǎn)化進行的水平方向的基因轉(zhuǎn)移是早已知道的事實。但近年來的研究表明，微生物似乎還善長向鄰居“借”或“盜用”(appropriate)基因。這些鄰居包括它們的“同類”微生物，也包括它們的“異類”高等動植物。基因組序列分析表明，生活在意大利海底火山口附近的激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)含有來自近鄰但親緣關(guān)系較遠的Thermococcus litotralis的轉(zhuǎn)運麥芽糖的基因，序列分析表明二者僅有138bp的差異，而生活在太平洋的同種激烈熱球菌卻沒有這種基因。激烈熱球菌的轉(zhuǎn)運麥芽糖基因看來是向T.litoaralis“借來”的，是否會“還”回去，目前難以得知。此外，微生物還有向

26、高等動、植物“盜用”(appropriate)基因的本領(lǐng)。例如，耐放射異常球菌(Deinococcus radiodurans)含有幾個只有在植物中才有的基因；結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的基因組上至少含有8個來自人的基因，而且這些基因編碼的蛋白質(zhì)能幫助細菌逃避宿主的防御系統(tǒng)，顯然，這是結(jié)核分枝桿菌通過某種方式從宿主那兒“盜用”了這些基因為自己的生存服務。有關(guān)“借”或“盜用”的機制目前還不很清楚，但轉(zhuǎn)座因子的普遍存在及其轉(zhuǎn)座功能可能起了很大的作用。* Penis i E. 1999, Science, 5418:13051306三、詹氏甲烷球菌(Meth

27、anococcus jannaschii)的基因組詹氏甲烷球菌屬于古生菌，該菌發(fā)現(xiàn)于1982年。生活在2600m深，260個大氣壓，94的海底火山口附近。1996年由美國基因組研究所(The Institute for Genomic Research，簡稱TIG R)和其它5個單位共40人聯(lián)合完成了該菌的基因組全測序工作。這是完成的第一個古生菌和自養(yǎng)型生物的基因組序列。根據(jù)對該菌全基因組序列分析結(jié)果完全證實了1977年由Woese等 人提出的三界學說。因此有人稱之為“里程碑”的研究成果。從目前已知的詹氏甲烷球菌和其它古生菌的基因組全序列分析結(jié)果來看，幾乎有一半的基因 通過同源搜索在現(xiàn)有的基因

28、數(shù)據(jù)庫中找不到同源序列。例如詹氏甲烷球菌只有40%左右的基因與其它二界生物有同源性，其中有的類似于真細菌，有的則類似于真核生物，有的就是二者融合?？梢哉f古生菌是真細菌和真核生物特征的一種奇異的結(jié)合體。一般而言，古生菌的基 因組在結(jié)構(gòu)上類似于細菌。例如：詹氏甲烷球菌有一個大小為1.66106bp的環(huán)形染色體DNA，具有1682個編碼蛋白質(zhì)ORF；功能相關(guān)的基因組成操縱子結(jié)構(gòu)，共轉(zhuǎn)錄成一個多順反子轉(zhuǎn)錄子；有2個rRNA操縱子；有37個tRNA基因，基本上無內(nèi)含子；無核膜等。但是負責信息傳遞功能的基因(復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯)則類似于真核生物，特別是古生菌的轉(zhuǎn)錄起始系統(tǒng)基本上與真核生物一樣，而與細菌的截然

29、不同。古生菌的RNA聚合酶在亞基組成和亞基序列上類同于真核生物的RNA聚合酶和，而不同于真細菌的RNA聚合酶。與之相應的是啟動子結(jié)構(gòu)也類同于真核生物，TATA box序列都位于轉(zhuǎn)錄起始點上游25-30核苷酸處，這與細菌啟動子的典型結(jié)構(gòu)(-10和-35)相悖。古生菌的翻譯延伸因子EF-Ia(細菌中是EF-Tu)和EF-2(細菌中是 EFG)，氨酰tRNA合成酶基因，復制起始因子等均與真核生物相似。此外，古生菌還有5個組蛋白基因，其產(chǎn)物組蛋白的存在可能暗示：雖然甲烷球菌基因圖譜看上去酷似細菌，但基 -因組本身在細胞內(nèi)可能實際上是按典型的真核生物樣式組織成真正的染色體結(jié)構(gòu)。同時具有細菌和真核生物基因

30、組結(jié)構(gòu)特征的古生菌對研究生命的起源和進化無疑是十分重要的，而許多古生菌特有的基因(目前還未搜索到與其它二界生物同源的基因)也正吸引著越來 越多的科學家去研究和探索，這些特有的基因也許為許多新奇的蛋白質(zhì)編碼，這將為開發(fā)新的藥物，生物活性物質(zhì)或在工業(yè)中實施新的技術(shù)開拓廣闊的前景。第三節(jié) 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子質(zhì)粒(plasmid)和轉(zhuǎn)座因子(transposable element)都是細胞中除染色體以外的另外二類遺傳因子。前者是一種獨立于染色體外，能進行自主復制的細胞質(zhì)遺傳因子，主要存在于各種微生物細胞中；后者是位于染色體或質(zhì)粒上的一段能改變自身位置的DNA序列，廣泛分布于原核和真核細胞中。目前對細菌中

31、的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子已研究得比較詳細，本節(jié)將以細菌為例介紹這兩種遺傳因子。一、質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)質(zhì)粒通常以共價閉合環(huán)狀(covalently closed circle，簡稱CCC)的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細胞中(圖8-3)，但從細胞中分離的質(zhì)粒大多是三種構(gòu)型，即CCC型、OC型(open circular form)和L型(linear form)(圖8-4)。近年來在疏螺旋體、鏈霉菌和酵母菌中也發(fā)現(xiàn)了線型雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒。質(zhì)粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb。圖8-3 電子顯微鏡下觀察到的完整的細菌染色體和質(zhì)粒(箭頭所指處為質(zhì)粒)圖8-4 質(zhì)粒的三種構(gòu)型根據(jù)質(zhì)粒的分子大小和結(jié)

32、構(gòu)特征，通過超離心或瓊脂糖凝膠電泳可將質(zhì)粒與染色體DNA分開，從而分離得到質(zhì)粒。這是因為雖然染色體DNA也是以超螺旋結(jié)構(gòu)存在于細胞中，但其分子大小遠遠超過質(zhì)粒(例如：大腸桿菌染色體是4100kb，而ColE1質(zhì)粒只有9kb)，因此在分離過程中染色體DNA總是會斷裂成線狀，其兩端可以自由轉(zhuǎn)動而使分子內(nèi)的緊張態(tài)完成松弛。而小分子的質(zhì)粒絕大多數(shù)是CCC或OC結(jié)構(gòu)，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA分子無自由末端，分子是緊密的纏結(jié)狀態(tài)，因此在含溴化乙錠(Ethidium bromide，簡稱EB，可與DNA和RNA分子結(jié)合，使其在紫外光照射下顯現(xiàn)熒光，便于觀察或分離)的氯化銫梯度中，松弛的染色體DNA結(jié)合的EB分子

33、比質(zhì)粒多，其密度也比質(zhì)粒小，經(jīng)高速密度梯度離心后，就可將二者分開，從而可分離得到質(zhì)粒DNA。瓊脂糖凝膠電泳則是根據(jù)分子量大小和電泳呈現(xiàn)的帶型將染色體DNA與質(zhì)粒分開。前者也是因隨機斷裂成線狀，且分子量大，所以泳動速度慢，帶型也不整齊；而后者分子量小，大小均一，泳動速度快，帶型整齊，很容易將二者區(qū)分并進而達到分離質(zhì)粒DNA。二、質(zhì)粒的主要類型染色體DNA作為細胞中的主要遺傳因子，攜帶有在所有生長條件下所必需的基因，這些基因有時稱之為“持家基因”(housekeeping gene)，而質(zhì)粒所含的基因?qū)λ拗骷毎话闶欠潜匦璧?，只是在某些特殊條件下，質(zhì)粒能賦予宿主細胞以特殊的機能，從而使宿主得到生長

34、優(yōu)勢。例如抗藥性質(zhì)粒和降解性質(zhì)粒能使宿主細胞在具有相應藥物或化學毒物的環(huán)境中生存，而且在細胞分裂時恒定的傳遞給子代細胞。根據(jù)質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應，可將其分為各種不同的類型： 1.致育因子(Fertility factor，F(xiàn)因子)又稱F質(zhì)粒，其大小約100kb，這是最早發(fā)現(xiàn)的一種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象(接合作用)有關(guān)的質(zhì)粒。攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株(相當 于雄性)，無F質(zhì)粒的菌株稱為F-菌株(相當于雌性)。F質(zhì)粒整合到宿主細胞染色體上的菌株稱之為高頻重組菌株(high frequence recombination, 簡稱Hfr)。由于F因子能以游離狀態(tài)(F+)和以與染色

35、體相結(jié)合的狀態(tài)(Hfr)存在于細胞中，所以又稱之為附加體(episome)。 F質(zhì)粒在大腸桿菌的接合作用(conjugation)中起主要作用。當Hfr菌株上的F因子通過重組回復成自主狀態(tài)時，有時可將其相鄰的染色體基因一起切割下來，而成為攜帶某一染色體基因的F因子，例如F-lac、F-gal、F-pro等。因此將這些攜帶不同基因的F因子統(tǒng)稱為F，帶有這些F因子的菌株也常用F表示。 2.抗性因子(Resistance factor，R因子) 這是另一類普遍而重要的質(zhì)粒，主要包括抗藥性和抗重金屬二大類，簡稱R質(zhì)粒。帶有抗藥性因子的細菌有時對于幾種抗生素或其他藥物呈現(xiàn)抗性。例如R1質(zhì)粒(94kb)可

36、使宿主對下列五種藥物具有抗性：氯霉素(Chlorampenicol, Cm)、鏈霉素(Streptomycin, Sm)、磺胺(Sulfonamide, Su)、氨芐青霉素(Ampicillin, Ap)和卡那霉素(Kanamycin, Km)，并且負責這些抗性的基因是成簇地存在于R1抗性質(zhì)粒上。許多R質(zhì)粒能使宿主細胞對許多金屬離子呈現(xiàn)抗性，包括碲(Te6+)、砷(As3+) 、汞(Hg2+)、鎳(Ni2+)、鈷(Co2+)、銀(Ag+)、鎘(Cd2+)等。 在腸道細菌中發(fā)現(xiàn)的R質(zhì)粒，約有25%是抗汞離子的，而銅綠假單胞菌中約占75%。 3.Col質(zhì)粒因這類質(zhì)粒首先發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌中而得名，該質(zhì)

37、粒含有編碼大腸菌素的基因，大腸菌素是一種細菌蛋白，只殺死近緣且不含Col質(zhì)粒的菌株，而宿主不受其產(chǎn)生的細菌素的影響。由G+細菌產(chǎn)生的細菌素通常也是由質(zhì)粒基因編碼，有些甚至有商業(yè)價值，例如一種乳酸細菌產(chǎn)生的細菌素NisinA能強烈抑制某些G+細菌的生長，而被用于食品工業(yè)的保藏。4.毒性質(zhì)粒(virulence plasmid)現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明，許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的，這些質(zhì)粒具有編碼毒素的基因，例如產(chǎn)毒素大腸桿菌是引起人類和動物腹瀉的主要病原菌之一，其中許多菌株含有為一種或多種腸毒素編碼的質(zhì)粒。有些使昆蟲 致病乃至死亡的細菌毒素也是由質(zhì)粒編碼的，蘇云金桿菌產(chǎn)生的毒素是這

38、種類型的典型例子 。研究表明，蘇云金桿菌含有編碼內(nèi)毒素(伴孢晶體中)的質(zhì)粒，伴孢晶體的結(jié)構(gòu)基因及調(diào)節(jié)基因位于質(zhì)粒上。此外，目前廣泛應用于轉(zhuǎn)基因植物載體的是一種經(jīng)過人工改造后的Ti質(zhì)粒(tumor-inducing-plasmid)(見第十章)，Ti質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子，其宿主是一種根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。是引起植物冠癭瘤的致病因子，其機制是Ti質(zhì)粒上的一段特殊DNA片段轉(zhuǎn)移至植物細胞內(nèi)并整合其染色體上，導致細胞無控制的瘤狀增生，合成正常植物所沒有的冠癭堿(opines)化合物，該DNA片段稱為T-DNA其上含有三個致癌基因。 發(fā)根土壤

39、桿菌(Agrobacterium rhizogenes)引起許多雙子葉植物患毛根瘤，而致病因子是該菌所含的Ri質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒在功能上與Ti質(zhì)粒有廣泛的同源性，也有一段特殊的DNA片段(T-DNA)，在侵染過程中，能轉(zhuǎn)移進植物基因組，也可用于轉(zhuǎn)基因植物載體。 5.代謝質(zhì)粒(Metabolic plasmid) 這類質(zhì)粒上攜帶有能降解某些基質(zhì)的酶的基因，含有這類質(zhì)粒的細菌，特別是假單胞菌，能將復雜的有機化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡單形式。尤其是對一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、農(nóng)藥(2,4-dichlorophenox yacetic acid)、辛烷和樟腦等的降解，在環(huán)境保護方

40、面具有重要的意義(見第十一章)。因此這類質(zhì)粒也常被稱為降解質(zhì)粒，每一種具體的質(zhì)粒常以其降解的底物而命名。如樟腦質(zhì)粒 (camphor, CAM)、辛烷質(zhì)粒(octadecane, OCT)、二甲苯質(zhì)粒(xylene, XYL)等。此外，代謝質(zhì)粒中還包括一些能編碼固氮功能的質(zhì)粒。例如根瘤菌中與結(jié)瘤(nod)和固氮(fix)有關(guān)的所有基因均位于共生質(zhì)粒中。放線菌中也已發(fā)現(xiàn)許多大的線型質(zhì)粒(500kb以上) 含有抗生素合成的基因。6.隱秘質(zhì)粒(cryptic plasmid)以上所討論的質(zhì)粒類型均具有某種可檢測的遺傳表型，但隱秘質(zhì)粒不顯示任何表型效應，它們的存在只有通過物理的方法，例如用凝膠電泳檢測

41、細胞抽提液等方法才能發(fā)現(xiàn)。他們存在的生物學意義，目前幾乎不了解。酵母的2m質(zhì)粒不授予宿主任何表型效應，也屬于隱秘型質(zhì)粒。除了根據(jù)質(zhì)粒賦予宿主的遺傳表型將質(zhì)粒分成不同類型外，還可根據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)、宿主范圍等將質(zhì)粒分成不同類型。例如：有些質(zhì)粒在每個宿主細胞中可以有10-100個拷貝，稱為高拷貝數(shù)(high copy number)質(zhì)粒，另一些質(zhì)粒在每個細胞中只有1-4個拷貝，為低拷貝數(shù)(Low copy number)質(zhì)粒。前者又稱松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)，后者又稱嚴謹型質(zhì)粒(stringent plasmid)。此外，還有一些質(zhì)粒的復制起始點(origin of replic

42、ation)較特異，只能在一種特定的宿主細胞中復制，稱為窄宿主范圍質(zhì)粒(narrow host range plasmid)；復制起始點不太特異，可以在許多種細菌中復制，稱為廣宿主范圍質(zhì)粒(broad host range plasmid)。能整合進染色體而隨染色體的復制而進行復制的質(zhì)粒又稱附加體(episome)。 三、質(zhì)粒的不親和性細菌通常含有一種或多種穩(wěn)定遺傳的質(zhì)粒，這些質(zhì)?？烧J為是彼此親和的(compatible)。但是如果將一種類型的質(zhì)粒通過接合或其它方式(如轉(zhuǎn)化)導入某一合適的但已含一種質(zhì)粒的宿主細胞，只經(jīng)少數(shù)幾代后，大多數(shù)子細胞只含有其中一種質(zhì)粒，那么這二種質(zhì)粒便是不親和的(in

43、compatible)，它們不能共存于同一細胞中。質(zhì)粒的這種特性稱為不親和性(incompatibility)。根據(jù)某些質(zhì)粒在同一細菌中能否并存的情況，可將質(zhì)粒分成許多不親和群(incompatibility group)，能在同一細菌中并存的質(zhì)粒屬于不同的不親和群，而在同一細菌中不 能并存的質(zhì)粒屬于同一不親和群。這是因為質(zhì)粒的不親和性現(xiàn)象主要與復制和分配有關(guān)，所以不能在同一細胞共存的質(zhì)粒是因為它們共享一個或多個共同的復制因子或相同的分配系統(tǒng) ，因此它們便屬于同一不親和群。只有那些具有不同的復制因子或不同分配系統(tǒng)的質(zhì)粒才能共存于同一細胞中，所以它們必然屬于不同的不親和群。因此到目前為止，可以說

44、這是一種接近質(zhì)粒本質(zhì)的一種分類方法，目前已在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了30多種不同的不親和群。當二種同一不親和群的質(zhì)粒共處同一細胞時，其中一種由于不能復制因而在細胞的不斷分裂過程中被稀釋掉(diluted out)，或被消除(curing)。所謂消除是指細胞中由于質(zhì)粒的復制受到抑制而染色體的復制并未明顯受到影響，細胞可繼續(xù)分裂的情況下發(fā)生的質(zhì)粒丟失。質(zhì)粒消除可自發(fā)產(chǎn)生，也可通過人工處理提高消除率，例如，用一定濃度的吖啶橙染料(acrid ine dyes)或其它能干擾質(zhì)粒復制而對染色體復制影響較小的理化因子處理細胞，可消除質(zhì)粒。四、轉(zhuǎn)座因子的類型和分子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)座因子是細胞中能改變自身位置(例如從染色體或質(zhì)

45、粒的一個位點轉(zhuǎn)到另一個位點，或者在二個復制子之間轉(zhuǎn)移)的一段DNA序列。廣泛存在于原核和真核細胞中（表8-3），由美國遺傳學家Barbara MeClintock首先在玉米中發(fā)現(xiàn)，并榮獲1983年度諾貝爾獎。原核生物中的轉(zhuǎn)座因子有三種類型：插入順序（insertion sequence, IS）、轉(zhuǎn)座子（transposon, Tn）和某些特殊病毒（如Mu、D108）。IS和Tn有二個重要的共同特征：它們都攜帶有編碼轉(zhuǎn)座酶（trans posase）的基因，該酶是轉(zhuǎn)移位置，即轉(zhuǎn)座（transposition）所必需的；另一共同特征是它們的二端都有反向末端重復序列（inverted termin

46、al repeat, ITR），該序列的長度為40bp（主要是IS）到1000bp以上（某些Tn）。圖8-5顯示IS2和Tn5的遺傳圖譜。表8-3原核和真核生物中的轉(zhuǎn)座因子原核生物真核生物 插入順序：IS酵母：sigma轉(zhuǎn)座子：Tn酵母：TY 病毒：Mu果蠅：copia,P玉米：Ac逆轉(zhuǎn)錄病毒：勞氏 肉瘤、人免疫缺陷病毒(HIV) IS是最簡單的轉(zhuǎn)座因子，分子大小范圍在2501600bp左右，只含有編碼轉(zhuǎn)座所必須的轉(zhuǎn)座酶的基因。它們分布在細菌的染色體、質(zhì)粒以及某些噬菌體DNA上。轉(zhuǎn)座子(Tn)比IS分子大，與IS的主要差別是Tn攜帶有授予宿主某些遺傳特性的基因，主要是抗生素和某些毒物(如汞離子

47、)抗性基因，也有其它基因，如：Tn951攜帶有負責乳糖發(fā)酵的基因。根據(jù)轉(zhuǎn)座子二端結(jié)構(gòu)的組成可將其分為二種類型。第一種類型是轉(zhuǎn)座子二端為順向或反向重復的IS，藥物抗性基因位于中間，IS提供轉(zhuǎn)座功能，連同抗性基因一起轉(zhuǎn)座，Tn5(圖8-5)是這一類型的代表，稱為復合轉(zhuǎn)座子(compound transposon)或類型轉(zhuǎn)座子。這一類型的轉(zhuǎn)座子實際上是IS因子的延伸。第二種類型的轉(zhuǎn)座子的兩端為短的反向重復序列 (IR)，其長度一般為30-50bp，在二個IR之間是編碼轉(zhuǎn)座功能和藥物抗性的基因(或其它基因 )，這類轉(zhuǎn)座子稱為類型或稱復雜轉(zhuǎn)座子(complex transposon)，Tn3(圖8-6)

48、是這一類型的典型代表。圖8-5 轉(zhuǎn)座因子IS2和Tn5的遺傳圖譜圖8-6Tn3的遺傳結(jié)構(gòu)Mu噬菌體是一種以大腸桿菌為宿主的溫和噬菌體，以裂解生長和溶源生長兩種方式交替繁衍自己。其基因組上除含有為噬菌體生長繁殖所必需的基因外，還有為轉(zhuǎn)座所必需的基因， 因此它也是最大的轉(zhuǎn)座因子，全長約39kb，圖8-7顯示Mu噬菌體的遺傳圖譜。從圖譜中可看出Mu基因組的實際長度只有37.2kb，因為該DNA分子的兩端并不是像IS和Tn那樣的反向重復序列，而是宿主DNA序列。左端的宿主DNA約為50-150bp，右端是1-2kb，這也是Mu噬菌體不同于其它噬菌體的獨特之處。兩端的宿主DNA是由于進入裂解循環(huán)的MuD

49、NA進行外殼裝配時，是從隨機插入的Mu基因組C端及其相鄰的50-150bp的宿主DNA開始一直到與S端相鄰接的1-2kb的 宿主DNA為止，也就是C端50-150bp的宿主DNA加37.2kb的Mu基因組和1-2kb的S端宿主DNA被包裝進外殼蛋白，而且由于Mu插入的位點不同，所以幾乎每一個噬菌體顆粒結(jié)合著不同的宿主 DNA序列。 圖8-7 Mu噬菌體的遺傳圖譜五、轉(zhuǎn)座的遺傳學效應轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座可引發(fā)多種遺傳學效應。這些效應不僅在生物進化上有重要的意義，而且已成為遺傳學研究中的一種重要的工具。這些遺傳變化主要包括：(1)插入突變 當各種IS、Tn等轉(zhuǎn)座因子插入到某一基因中后，此基因的功能喪失，

50、發(fā)生突變。如果插入位于某操縱子的前半部分，就可能造成極性突變，導致該操縱子后半部分結(jié)構(gòu)基因表達失活。如果插入的是帶有抗性(或其它)基因的轉(zhuǎn)座子，則可獲得帶有新的基因標記的插入突變。(2)產(chǎn)生染色體畸變由于復制性轉(zhuǎn)座是轉(zhuǎn)座子一個拷貝的轉(zhuǎn)座，處在同一染色體上不同位置的二個拷貝之間可能發(fā)生同源重組，這種重組過程可導致DNA的缺失或倒位，即染色體畸變。(3)基因的移動和重排由于轉(zhuǎn)座作用可能使一些原來在染色體上相距甚遠的基因組合到一起，構(gòu)建成一個操縱子或表達單元，也可能產(chǎn)生一些具有新的生物學功能的基因和新的蛋白質(zhì)分子，具有生物進化上的重要意義。 第四節(jié) 基因突變及修復一個基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任

51、何改變，包括一對或少數(shù)幾對堿基的缺失、插入或置換，而導致的遺傳變化稱為基因突變(gene mutation)，其發(fā)生變化的范圍很小，所以又稱點突變(point mutati on)或狹義的突變。廣義的突變又稱染色體畸變(chromosomal aberration)，包括大段染色體的缺失、重復、倒位?；蛲蛔兪侵匾纳飳W現(xiàn)象，它是一切生物變化的根源，連同基因轉(zhuǎn)移、重組一起提供了推動生物進化的遺傳多變性。也是我們用來獲得優(yōu)良菌株的重要途徑之一。DNA損傷的修復和基因突變有著密切的關(guān)系，當DNA的某一位置的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變(稱為前突)時，并不意味著一定會產(chǎn)生突變，因為細胞內(nèi)存在一系列的修復系統(tǒng) ，能

52、清除或糾正不正常的DNA分子結(jié)構(gòu)和損傷，從而阻止突變的發(fā)生，因此前突可以通過DNA復制而成為真正的突變，也可以重新變?yōu)樵瓉淼慕Y(jié)構(gòu)，這取決于修復作用和其它多種因素。本節(jié)將對基因突變、修復及二者的相關(guān)性進行討論。 一、基因突變的類型及其分離1.堿基變化與遺傳信息的改變 不同的堿基變化對遺傳信息的改變是不同的，可分為四種類型(圖8-8)。 圖8-8 遺傳信息的改變與突變類型(1)同義突變(same-sense mutation) 這是指某個堿基的變化沒有改變產(chǎn)物氨基酸序列的密碼子變化，顯然，這是與密碼子的簡并性相關(guān)的。 (2)錯義突變(mis-sense mutation) 是指堿基序列的改變引起了

53、產(chǎn)物氨基酸的改變。有些錯義突變嚴重影響到蛋白質(zhì)活性甚至使之完全無活性，從而影響了表型。如果該基因是必需基因，則該突變?yōu)橹滤劳蛔?lethal mutation)。(3)無義突變(nonsense mutation) 是指某個堿基的改變，使代表某種氨基酸的密碼子變?yōu)榈鞍踪|(zhì)合成的終止密碼子(UAA，UAG，UGA)。蛋白質(zhì)的合成提前終止，產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)。 (4)移碼突變(frameshift mutation) 由于DNA序列中發(fā)生1-2個核苷酸的缺失式插入，使翻譯的閱讀框發(fā)生改變，從而導致從改變位置以后的氨基序列的完全變化。2.表型變化 表型(phenotype)和基因型(genotype)是

54、遺傳學中常用的二個概念，前者是指可觀察或可檢測到的個體性狀或特征，是特定的基因型在一定環(huán)境條件下的表現(xiàn)；后者是指貯存在遺傳物質(zhì)中的信息，也就是它的DNA堿基順序。上述四種類型的突變，除了同義突變外，其它三種類型都可能導致表型的變化。下面主要介紹幾種常用的表型變化的突變型及其分離。 (1)營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)一種缺乏合成其生存所必須的營養(yǎng)物的突變型，只有從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營養(yǎng)或其前體物(precursor)才能生長。它的基因型常用所需營養(yǎng)物 的前三個英文小寫斜體字母表示，例如hisC、lacZ分別代表組氨酸缺陷型和乳糖發(fā)酵缺陷型，其中的大寫字母C和Z則表示同一表型中不同基因

55、的突變。相應的表型則用HisC和LacZ(第一個字母大寫)表示。在容易引起誤解的情況下，則用hisA-和hisA+，lacZ-和lacZ+分別表示缺陷型和野生型(Wildtype gene,沒有發(fā)生突變的基因)。營養(yǎng)缺陷型是微生物遺傳學研究中重要的選擇標記和育種的重要手段，由于這類突變型在選 擇培養(yǎng)基( 或基本培養(yǎng)基)上不生長，所以是一種負選擇標記，需采用影印平板(Replica plating)的方法進行分離，步驟如下：將待分離突變株的原始菌株以合適的稀釋度涂布到野生型菌株和突變株均能生長的主平板(含完全培養(yǎng)基)上，經(jīng)培養(yǎng)后形成單菌落(圖8-9a)；通過一消毒的“印章”(直徑略小于培養(yǎng)皿底，

56、表面包有絲絨布，使其盡量平整，圖8-9b)將A平板的菌落分別原位轉(zhuǎn)移(或印跡)到C平板(含有與A平板相同的營養(yǎng)成份)和D平板(不含缺陷型所 需的營養(yǎng)因子，即基本培養(yǎng)基)；經(jīng)培養(yǎng)后對照觀察c和d平板上形成的單菌落，如果在c平板上長而在d平板上不長的，則為所需分離的突變型；在c平板上挑取d平板上不長的相應位置的單菌落，并進一步在完全培養(yǎng)基上劃線分離純化。圖8-9 印影法分離營養(yǎng)缺陷型(2)抗藥性突變型(resistant mutant) 由于基因突變使菌株對某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性的一種突變，普遍存在于各類細菌中，也是用來篩選重組子和進行其它遺傳學研究的重要正選擇標記(見第十章)。

57、這類突變類型常用所抗藥物的前三個小寫斜體英文字母加上“r”表示，如：strr和strs分別表示對鏈霉素的抗性和敏感性(sensitivity)。在加有相應抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到。 (3)條件致死突變型(conditional lethal mutant)是指在某一條件下具有致死效應，而在另一條件下沒有致死效應的突變型。這類突變型常被用來分離生長繁殖必需的突變基因。因為這類基因一旦發(fā)生突變是致死的(例如為DNA復制所必需的基因)，因而也就不可能得到這些基因的突變。常用的條件致死突變是溫度敏感突變，用ts(temperaturesensitive)表示，這類突變在高溫下(如42)是致死的，但可以在低溫(如25-30)下得到這種突變。篩選ts 突變型的方法也是采用影印平板法，所不同的是圖8-9中的三個平板上培養(yǎng)基相同，均可生長。只是將C和D平板分別置低溫(30)和高溫(42)下培養(yǎng)，然后在C平板上挑取相應于D平板上未生長的菌落。(4)形態(tài)突變型(morphological mutant)是指造成形態(tài)改變的突變型，包括影響細胞和菌落形態(tài)、顏色