動物疫病監(jiān)測采樣技術(shù).ppt

動物疫病監(jiān)測的采樣技術(shù) 2009年6月11日,動物疫病監(jiān)測,定義：調(diào)查動物群體中某種疫病或病原的存在情況。 通過監(jiān)測可以了解動物疫病的流行現(xiàn)狀、危害程度、風(fēng)險因子和發(fā)展趨勢，早期識別疫病的爆發(fā)和流行。 根據(jù)信息來源分為：問卷調(diào)查和實驗室監(jiān)測。 實驗室監(jiān)測的關(guān)鍵:樣品和檢測技術(shù)。,實驗室檢測技術(shù),病原檢測：病原本身檢測，病原特有蛋白檢測，病原特有核酸檢測，動物試驗 抗體檢測：瓊擴，試管凝集，平板凝集，血凝和血凝抑制，中和試驗，各種ELISA等。 在檢測技術(shù)過關(guān)的情況下，監(jiān)測結(jié)果是否具有代表性，是否能夠真實反映出疫病的真實情況都與監(jiān)測樣品的采集有重要關(guān)系。,一、樣品存在的問題,樣品的真實性（假樣品，一個樣品分開） 樣品的質(zhì)量（溶血，腐敗，反復(fù)凍融） 采樣單填寫的信息不全（畜禽日齡，免疫情況等） 組織樣品采集的太大，不專業(yè)。 每一種類的樣品用一個采樣單。 樣品編號不能追溯回去。,二、樣品的種類,血液樣品：血清，全血抗凝血，血漿 組織樣品：心肝脾肺腎腦，淋巴結(jié)，扁桃體 糞便樣品：新鮮，濕潤的 生殖道和精液樣品 皮膚樣品：皮屑 分泌液和滲出液樣品：舌面或蹄部的水泡液,血液樣品,血液：最常用的樣品，可以做血清學(xué)試驗的樣品，也可以作為病原學(xué)試驗的樣品。 全血（抗凝血）：抗凝劑有肝素，阿氏液，枸櫞酸鈉和4%EDTA，或者用玻璃珠，脫纖維蛋白。 血清：不加抗凝劑的血液，在室溫靜置24h（或371h），待血液完全凝固后，析出上清即為血清。 血漿：抗凝血混勻后，靜置，上清即為血漿。,檢測樣品的分類,細(xì)菌學(xué)檢測樣品：采集發(fā)病典型或剛死亡的整體動物送實驗室為最好。無菌采集，冷藏，保存液中不加任何抗生素。 病毒學(xué)檢測樣品：病毒檢測應(yīng)在動物病初、體溫升高期間采集。以組織臟器、血液、糞便等樣品為主 。冷藏或冷凍，保存液中加抗生素。 血清學(xué)檢測樣品：靜脈采血3 ml左右，注射器內(nèi)留一定空間，靜置過程或已凝固的血液應(yīng)低溫冷凍，以免溶血。短時間內(nèi)，可在4度左右保存；如時間較長應(yīng)凍結(jié)保存，注意不能反復(fù)凍融. 病理學(xué)檢測樣品：保證樣品新鮮，應(yīng)選擇病變最典型最明顯的部位，且連同部分健康組織一并采集。 浸泡于酒精或福爾馬林溶液中，冷藏保存和運輸。,幾種重要疫病的采樣時機,禽流感、新城疫：發(fā)病初期采全血，泄殖腔咽喉棉拭子；后期采集新鮮糞便；剖剪后的氣管，肺臟，腎臟等 口蹄疫：全血，水泡皮，水泡液，O/P液及口腔分泌物和咽喉棉拭子 豬瘟，豬偽狂犬，藍(lán)耳病：全血，血清，組織病料：肺臟，脾臟，淋巴結(jié)，扁桃體，流產(chǎn)胎衣等，新鮮精液或冷凍精液 豬流感：在發(fā)熱期采集鼻咽棉拭子和肺組織病料。,三、高品質(zhì)樣品的特征,樣品標(biāo)記明確,樣品新鮮,采樣單填寫規(guī)范,樣本樣品數(shù)量適當(dāng),四、如何得到高質(zhì)量的樣品,1、采樣前的準(zhǔn)備-器具,采樣工具：一次性注射器，解剖刀，剪刀，鑷子，酒精燈，酒精棉，棉簽，保定動物專用工具 樣品存放用具：塑料離心管（1.5，2，5ml），自封口樣品袋，試管架，塑料樣品盒，膠布，封口膜，冰袋。 防護(hù)用具：一次性手套，鞋套，口罩，隔離衣等。 記錄用具：不干膠標(biāo)簽、圓珠筆、油性記號筆、采樣單、記錄本等,2、采樣前準(zhǔn)備采樣技術(shù),血液樣品：牛、馬、羊從頸靜脈或尾靜脈采血；豬從前腔靜脈采血，用量少時也可從耳靜脈抽??；家禽從翅靜脈抽取。 棉拭子樣品：泄殖腔，咽喉，鼻腔 水泡皮及水泡液： O/P液：保定，左手拉出舌頭或從嘴的一側(cè)按住舌頭，右手緩慢放入探杯。 組織樣品：解剖，潔凈取樣。,血液樣品的分離方法,抗凝血：采血前在試管或注射器內(nèi)按比例加抗凝劑，運輸時必須減少震蕩以免溶血。 非抗凝血：分離血清 血清析出好的因素：容器：玻璃試管優(yōu)于塑料離心管；斜面：與空氣接觸面要大。溫度：最佳溫度是體溫；時間：室溫靜置最短2小時；離心：轉(zhuǎn)速要低，2000轉(zhuǎn)。 膠凍狀血清的成因：采血前剛剛喂食（沒有空腹）；凝血時間不夠；脂肪血（營養(yǎng)過剩）,糞便、棉拭子和O/P液樣品的采集,泄殖腔拭子的采集：將棉拭子插入泄殖腔約1.52cm,旋轉(zhuǎn)后沾上糞便。 咽喉拭子、鼻腔拭子的采集：將滅菌的干棉拭子插入口腔至咽的后部或鼻腔，輕輕擦拭并慢慢旋轉(zhuǎn)將拭子拔出，將棉拭子放入緩沖液內(nèi)。 O/P液是從動物食道/咽喉刮取的黏膜樣品，用特制的食道探環(huán)刮取黏膜，放入樣品保存液中。,水泡液及水泡皮的采集,用75%酒精消毒水泡表皮，用滅菌生理鹽水擦去酒精，用注射器穿刺吸取水泡液，置于含抗生素的PBS緩沖液中；然后用剪刀將水泡皮剪下，放入含抗生素的PBS緩沖液中。,3、采樣的準(zhǔn)確性和時效性,代表性：應(yīng)該考慮到整個監(jiān)測區(qū)域的地理分布，選取有代表性的點。如動物品種分布、日齡、飼養(yǎng)密度、地勢特點、交通特點、動物遷徙習(xí)性等因素。如禽流感采樣時，疫區(qū)交接處，野鳥遷徙途徑，水禽家禽混合飼養(yǎng)處等。 時效性：如抗體監(jiān)測，免疫后14天左右才可以采集；監(jiān)測病原時，注意排毒時間和病原的易嗜細(xì)胞和組織，在監(jiān)測時要根據(jù)不同時期，采集不同部位的組織進(jìn)行檢測。如口蹄疫病毒首先是在咽喉部和肺上皮細(xì)胞擴增，然后進(jìn)入血液，通過分泌物、水泡排毒。,樣本樣品的數(shù)量,樣本：總體中的一部分代表；樣品：檢測的原始材料。 概率抽樣（隨機抽樣）：是按照隨機原則進(jìn)行抽樣，不加主觀因素，組成總體的每個單位都有被抽中的概率（非零概率） 比例抽樣：按養(yǎng)殖規(guī)模成比例抽樣。 多階段抽樣：全市分區(qū)，每個區(qū)隨機選縣，每個縣選鄉(xiāng)鎮(zhèn)，每個鄉(xiāng)鎮(zhèn)選養(yǎng)殖場。 樣本量，符合統(tǒng)計學(xué)要求，決定因素：疫病在群體中的發(fā)生率，可信水平，檢測方法 的敏感性和特異性。 樣品的量要足夠檢測使用。,4.1樣品的包裝和編號,單個樣品的包裝 動物血清、全血、棉拭子、水泡液，加有PBS的糞便等液體樣品用用1.5ml，2ml，5ml帶蓋的塑料離心管； 組織病料等固體樣品用自封口樣品袋，或放入1.5ml及2ml塑料離心管； 每次送樣的同一種樣品進(jìn)行編號，每個樣品都要有唯一編號，標(biāo)識清楚，不易丟失。 每組樣品的包裝 以鎮(zhèn)或每個采樣點為單位分組，每組一個大包裝，用自封口樣品袋包裝，并貼有標(biāo)簽，注明樣品名、樣品編號、采樣日期等。,4.2樣品的記錄,單個樣品的小塑料離心管外用油性記號筆標(biāo)記 每組樣品自封袋外用鋼筆填寫樣品標(biāo)簽和封條 編號與采樣單一致，具有唯一性和可追溯性。 填寫采樣單：被采樣畜主的聯(lián)系方式和采樣人的聯(lián)系方式；被采樣動物的健康狀況和免疫狀況；被采樣動物的聯(lián)系方式（畜種，日齡，標(biāo)識號等）；樣品運輸方式；日期，簽名（采樣人，畜主）。 青島市動物疫病監(jiān)測采樣單 每類樣品要求填寫一份采樣單。,5、樣品追溯,樣品編號和填寫采樣單目的就是對檢測結(jié)果的追溯。 動物防疫法規(guī)定動物免疫抗體監(jiān)測、動物疫病病原監(jiān)測、動物疫病應(yīng)急流行病學(xué)調(diào)查等均實行可追溯制度。 追溯內(nèi)容：家禽來源、飼養(yǎng)周期、防疫情況、免疫程序、疫苗及獸藥的使用情況。 抗體監(jiān)測要求追溯到每棟，每舍。 病原學(xué)監(jiān)測必須追溯到每只，每頭。,6.1樣品的保存,血清：4-8冷藏，不超過2周；抗凝血： 4-8冷藏，不超過1周； 病毒檢驗材料：短時間可冷藏，否則須-20 或-70 以下保存，無條件的可置滅菌50%甘油-PBS液中冷藏，不宜反復(fù)凍融。 細(xì)菌檢驗病料：冷藏，不宜冷凍，可置滅菌的30%甘油-PBS液/鹽水中冷藏。 所有凍存樣品忌反復(fù)凍融,6.2樣品的運輸,關(guān)鍵是：容器（密閉）溫度（低溫）時間（越快越好） 容器：密封容器，防止?jié)B漏，造成環(huán)境污染或疫情擴散。 溫度：樣品應(yīng)在低溫下保存和運輸（放置冰塊）。 拭子樣品和組織樣品應(yīng)作暫時的冷藏或冷凍處理，然后運送。血清樣品，若 24h內(nèi)運達(dá)實驗室，冷藏運輸；若超過 24h，要先冷凍后，再冷藏運輸，途中不能超過 48h。 時間：若能在4h內(nèi)送到實驗室，可用冰袋冷藏運輸。如果超過4h，應(yīng)置于-30 作冷凍處理，再在保溫箱內(nèi)加冰袋運輸，在24h內(nèi)送到。若 24h不能送到實驗室，則運輸過程中環(huán)境溫度應(yīng)保持在-20 以下（干冰）。,樣品運輸保存液,2550甘油生理鹽水 PH 7.27.6的肉湯 Hanks液、MEM培養(yǎng)基（雙抗） 含雙抗的PBS緩沖液,五、采樣時注意事項,注意