實(shí)驗(yàn)三-離心技術(shù)及酶學(xué)實(shí)驗(yàn).ppt

實(shí)驗(yàn)三 離心技術(shù)及 酶學(xué)實(shí)驗(yàn),概念 生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒(細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離的一種技術(shù)。沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度，離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備。,第一節(jié) 基本原理,離心力 當(dāng)一個(gè)粒子(生物大分子或細(xì)胞器)在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時(shí)，此離心力“F”由下式定義，即：,相對(duì)離心力（RCF） 通常離心力常用地球的引力的倍數(shù)來表示，所以稱為相對(duì)離心力。 在離心場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度g（980cm/s2）。, RCF = 1.11910-5(rpm)2r (rpm-revolutions per minute為每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min) 低速離心時(shí)常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示 高速離心時(shí)則以“g”表示,第二節(jié) 離心機(jī)的主要構(gòu)造和類型,工業(yè)用離心機(jī) 離心機(jī) 制備性離心機(jī) 實(shí)驗(yàn)用離心機(jī) 分析性離心機(jī),一、制備性離心機(jī)的三類 1 普通離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速6000rpm左右 2 高速冷凍離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為20000 25000rpm（r/min） 3超速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)5000080000rpm， 超速離心機(jī)裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離 心機(jī)的主要區(qū)別。,二、轉(zhuǎn)頭,1角式轉(zhuǎn)頭,2蕩平式轉(zhuǎn)頭： 這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4或6個(gè)自由活動(dòng) 的吊桶(離心套管)構(gòu)成。 3區(qū)帶轉(zhuǎn)頭： 區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個(gè)轉(zhuǎn)子 桶和可旋開的頂蓋組成。 4 垂直轉(zhuǎn)頭： 其離心管是垂直放置的。 5 連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)頭： 轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口 的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成。,三、離心管,塑料離心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點(diǎn)是透明(或半透明)，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點(diǎn)是易變形，抗有機(jī)溶劑腐蝕性差，使用壽命短。,不銹鋼管強(qiáng)度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕。但用時(shí)也應(yīng)避免接觸強(qiáng)腐蝕性的化學(xué)藥品，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。 離心管蓋 離心前必須蓋嚴(yán)，配平時(shí)需帶管蓋重量 防止樣品外泄、揮發(fā) 支持離心管，防止離心管變形,制備性超速離心的分離方法 差速沉降離心法 逐漸增加離心速度，或者低速、高速交替進(jìn)行離心，使不同的離心速度及不同離心時(shí)間下分批分離的方法。 用途：分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便 缺點(diǎn)：分理效果差，顆粒受擠壓易變性失活,密度梯度區(qū)帶離心法（區(qū)帶離心法） 定義：將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。 優(yōu)點(diǎn)：分理效果好、適應(yīng)范圍廣、顆粒不會(huì)擠壓變形保持活性 缺點(diǎn)：離心時(shí)間長(zhǎng)、需制備惰性梯度介質(zhì)溶液、操作嚴(yán)格不易掌握,五、離心操作的注意事項(xiàng),使用各種離心機(jī)時(shí)，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，轉(zhuǎn)頭中絕對(duì)不能裝載單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時(shí)，管子必須互相對(duì)稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。 每個(gè)轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累計(jì)期限，使用轉(zhuǎn)頭時(shí)要查閱說明書，不得過速使用。,裝載溶液時(shí)，要根據(jù)各種離心機(jī)的具體操作說明進(jìn)行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時(shí)甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕;而制備性超速離心機(jī)的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時(shí)塑料離心管的上部凹陷變形。 若要在低于室溫的溫度下離心時(shí)。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。 離心過程中不得隨意離開,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,酶的提取及比活性測(cè)定,一、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)的分離純化及比活性測(cè)定,目的 1掌握AKP分離純化的實(shí)驗(yàn)原理、方法 及注意事項(xiàng) 2了解檢測(cè)AKP活性測(cè)定的原理和方法。,方法 酶的本質(zhì)：蛋白質(zhì) 鹽析法 有機(jī)溶劑沉淀法 層析法 電泳,酶,組織細(xì)胞：先破碎細(xì)胞， 再用一定的試劑提取,原則 制備的原料 初期采用、后期采用方法 影響因素,影響因素 pH：最適pH 溫度：低溫時(shí)酶比較穩(wěn)定，有機(jī)溶劑需預(yù)冷 氧化：SH對(duì)某些酶的活性必需，加入還原劑 重金屬離子污染：與SH發(fā)生作用而失活：EDTA 蛋白酶的污染，PMSF、DFP 介質(zhì)的極性和離子強(qiáng)度：疏水,最穩(wěn)定pH,評(píng)估指標(biāo) 酶的純度用比活性代表 定義：?jiǎn)挝恢亓浚╩g）蛋白樣品中所含酶的活性單位 表示方法：每mg蛋白質(zhì)所具有酶的活性單位 測(cè)定方法：每ml樣品中的蛋白質(zhì)mg數(shù) 每ml樣品中酶的活性單位 酶的活性單位：酶促反應(yīng)在單位時(shí)間（秒、分鐘、小時(shí)）內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所需要的酶量。,酶的回收率 提取純化過程中雜蛋白逐步去除，同時(shí)伴隨部分酶的損失。 在保證純度的前提下，應(yīng)盡可能提高酶的收率。,原理 機(jī)械破碎法制備肝勻漿 勻漿液 低濃度醋酸鈉：低滲破膜 低濃度醋酸鎂：保護(hù)和穩(wěn)定AKP 有機(jī)溶劑沉淀法分離純化AKP 加入不同有機(jī)溶劑，重復(fù)離心 正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白質(zhì) 33丙酮(30乙醇)：AKP溶解 50丙酮(60乙醇)：AKP不溶解,(一)堿性磷酸酶的分離提純,操作步驟,25g肝組織剪碎 +0.01M醋酸鎂-醋酸鈉溶液75ml，勻漿機(jī)中勻漿 取肝勻漿4ml(A液）,A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測(cè)比活性,A2：取0.1mlA液+4.9ml生理鹽水，待測(cè)蛋白濃度,+2ml正丁醇，混勻2min，室溫置30min，離心 （2500rpm)5min 下清液（吸?。?沉淀（棄） +等體積丙酮，離心（2000rpm)5min 上清液（棄） 沉淀 +0.5M醋酸鎂2ml溶解（B液）,操作步驟,B 液 +95%冷乙醇至30%，離心（2500rpm）5min 上清液（吸?。?沉淀（棄） + 95%冷乙醇至60%，離心（2500rpm）5min 上清液（棄） 沉淀 +0.01M 醋酸鎂-醋酸鈉2ml,溶解（C液） C1：取0.1mlC液+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測(cè)比活性 C2：取0.1mlC液+0.1ml生理鹽水，待測(cè)蛋白濃度,B1：取0.1mlB液+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測(cè)比活性,B2：取0.1mlB液+0.9ml生理鹽水，待測(cè)蛋白濃度,加入有機(jī)溶劑計(jì)算公式 設(shè)加入Xml95%乙醇 至終濃度30% 30%（B液體積+X）=95%X X=30%B液體積95%-30%=0.462B液體積 至終濃度60% 60%（上清液體積+X）30%上清液體積=95%X X=（60%-30%）上清液體積 95%-60%=0.867上清液體積,注意事項(xiàng),各步加入有機(jī)溶劑量要準(zhǔn)確。否則會(huì)影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 操作要在低溫下進(jìn)行 加入有機(jī)溶劑時(shí)要慢慢滴加，充分?jǐn)嚢?，避免局部濃度過高而引起升溫和變性。 加入有機(jī)溶劑混勻后不宜放置過久，應(yīng)立即離心。 離心析出的蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)立即將溶于適量的緩沖液中，以避免酶活力的喪失。,(二)堿性磷酸酶的比活性測(cè)定,原理 比活性的定義 單位重量的蛋白質(zhì)樣品中所含的酶活性單位。 通常用每毫克蛋白質(zhì)具有的酶活性單位來表示。 用以鑒定酶的純化程度，是酶提取與純化成功與否的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。,測(cè)定樣品的比活性必須測(cè)定： 每毫升樣品中的酶活性單位數(shù)。 每毫升樣品中的蛋白質(zhì)毫克數(shù)。,磷酸苯二鈉法測(cè)定堿性磷酸酶活性 AKP 4-氨基安替比林 磷酸苯二鈉 酚 醌衍生物（紅色） 鐵氰化鉀 根據(jù)紅色的深淺用比色法測(cè)定酚的含量。 37保溫15分鐘產(chǎn)生1g酚者為1個(gè)酶活性單位。,考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 回顧實(shí)驗(yàn)原理（實(shí)驗(yàn)講義第60頁）。,操作步驟 1.AKP活性單位測(cè)定 取試管5支，按下表操作：,加0.2M NaOH溶液1ml 加0.3%4-氨基安替比林1ml, 0.5%鐵氰化鉀溶液2ml，混勻，室溫10min，各溶液進(jìn)行A510測(cè)定 計(jì)算：酶活性單位/ml