GB5413.15-2010發(fā)布稿嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定發(fā)布稿.pdf

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.152010中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實施食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定National food safety standard Determination of vitamin niacin and niacinamide in foods for infants and young children,milk and milk products GB 5413.152010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)第二法等同采用國際分析家學(xué)會（AOAC）944.13 Niacin and Niacinamide(Nicotinic Acid and Nicotinamide) in Vitamin Preparations。 本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 5413.15-1997嬰幼兒配方食品和乳粉 煙酸和煙酰胺的測定 。 本標(biāo)準(zhǔn)第二法與GB 5413.15-1997相比，主要變化如下： 增加了光密度法測定； 增加了淀粉類試樣的測定； 增加標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的文字描述。 本標(biāo)準(zhǔn)附錄 A 為資料性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： GB 5413-1985、GB/T 5413.15-1997。 GB 5413.152010 1 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定。 2 規(guī)范性引用性文件 本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 第一法 高效液相色譜法 3 原理 試樣經(jīng)熱水提取、酸性沉淀蛋白質(zhì)后，以 C18 色譜柱分離，用紫外檢測器定量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。 4.1 淀粉酶：酶活力1.5 U/mg。 4.2 鹽酸。 4.3 氫氧化鈉。 4.4 鹽酸(2.4 mol/L)：準(zhǔn)確移取 10 mL 鹽酸（4.2）于 50 mL 容量瓶中，用水定容。 4.5 氫氧化鈉溶液（2.5 mol/L）：稱取 5.0g 氫氧化鈉（4.3）于 50 mL 容量瓶中，用水定容。 4.6 高氯酸（HClO4）：體積分數(shù)為 60%。 4.7 甲醇（CH4O）：色譜純。 4.8 異丙醇(C3H8O)：色譜純。 4.9 庚烷磺酸鈉(C7H15NaO3S)：優(yōu)級純。 4.10 標(biāo)準(zhǔn)溶液 4.10.1 煙酸及煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液 （1.0 mg/mL） ： 稱取煙酸及煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品各 0.1 g （精確到 0.0001 g） ，分別置于 100 mL 容量瓶中，用水溶解定容。 4.10.2 煙酸及煙酰胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（40 g/mL）：分別準(zhǔn)確吸取煙酸及煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液（4.10.1）2 mL 至 50 mL 定量瓶中，用水定容。臨用前配制。 GB 5413.152010 2 4.10.3 煙酸及煙酰胺混合標(biāo)準(zhǔn)系列測定液：分別準(zhǔn)確吸取煙酸及煙酰胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（4.10.2）0.0 mL、 1.0 mL、 2.0 mL、 5.0 mL、 10.0 mL， 至 50 mL 容量瓶中用水定容。 該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為 0.00 g/mL、0.80 g/mL、1.60 g/mL、4.00 g/mL、8.00 g/mL。臨用前配制。 5 儀器和設(shè)備 5.1 高效液相色譜儀，帶紫外檢測器。 5.2 pH 計：精度為 0.01。 5.3 超聲波振蕩器。 5.4 天平：感量為 0.1 mg。 5.5 培養(yǎng)箱：30 80 。 6 分析步驟 6.1 試樣的預(yù)處理 6.1.1 含淀粉的試樣：稱取混合均勻固體試樣約 5.0 g（精確到 0.0001 g）加入約 25 mL 45 50 的水，或稱取混合均勻液體試樣約 20.0 g（精確到 0.0001 g）于 150 mL 錐形瓶中，再加入約 0.5 g 淀粉酶（4.1），搖勻后向錐形瓶中充氮，蓋上瓶塞，置于 50 60 的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約 30 min，取出冷卻至室溫。 6.1.2 不含淀粉的試樣：稱取混合均勻固體試樣約 5.0 g（精確到 0.0001 g）加入約 25 mL 45 50 的水，或稱取混合均勻液體試樣約 20.0 g（精確到 0.0001 g）于 150 mL 錐形瓶中，振搖，靜置 5 min10 min，充分溶解，并冷卻至室溫。 6.1.3 提取：將上述錐形瓶置于超聲波振蕩器中振蕩約 10 min。 6.1.4 沉淀及定容：待試樣溶液降至室溫后，用鹽酸（4.4）調(diào)節(jié)試樣溶液的 pH 值至 1.7 0.1，放置約2 min 后，再用氫氧化鈉溶液（4.5）調(diào)節(jié)試樣溶液的 pH 值至 4.5 0.1。將試樣溶液轉(zhuǎn)至 50 mL 容量瓶中，用水反復(fù)沖洗錐形瓶，洗液合并于 50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，混勻后經(jīng)濾紙過濾，濾液再經(jīng) 0.45 m 微孔濾膜加壓過濾，用試管收集，即為試樣待測液。 6.2 參考色譜條件 色譜柱：C18 柱（粒徑5 m，150 mm 4.6 mm）或具有同等性能的色譜柱。 流動相：甲醇（4.7）70 mL，異丙醇（4.8）20 mL，庚烷磺酸鈉（4.9）1 g，用910 mL水溶解并混勻后，用高氯酸（4.6）調(diào)pH至2.1 0.1，經(jīng)0.45 m膜過濾。 流速：1.0 mL/min。 檢測波長：261 nm。 柱溫：25 。 進樣量：10 L。 6.3 定量分析 6.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將煙酸及煙酰胺混合標(biāo)準(zhǔn)系列測定液（4.10.3）依次進行色譜測定（其標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖參見附錄 A中圖 A.1.1）。記錄各組分的色譜峰面積或峰高，以峰面積或峰高為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)測定液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 GB 5413.152010 3 6.3.2 試樣測定 將試樣待測液（6.1.4）進行色譜測定。記錄各組分色譜峰面積或峰高，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出試樣待測液中煙酸及煙酰胺各組分的濃度 ci。 7 分析結(jié)果的表述 7.1 試樣中煙酸或煙酰胺含量的計算 試樣中煙酸或煙酰胺的含量按（1）式計算： mVcXi10021=或 （1） 式中： X1或2試樣中煙酸或煙酰胺的含量，單位為微克每百克（g/100 g） ； m試樣的質(zhì)量，單位為克（g） ； ci試樣待測液中煙酸或煙酰胺的濃度，單位為微克每毫升（g/mL）； V試樣溶液的體積，單位為毫升（mL） 。 7.2 試樣中維生素PP總含量的計算 試樣中維生素PP的總含量按（2）式計算： X 12XX+ （2） 式中： X試樣中維生素 PP 的總含量，單位為微克每百克（g/100 g） ； X1試樣中煙酸的含量，單位為微克每百克（g/100 g）； X2試樣中煙酰胺的含量，單位為微克每百克（g/100 g）。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。 8 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10 %。 第二法 微生物法 9 原理 利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ATCC 8014 對煙酸和煙酰胺的特異性，在含有煙酸和煙酰胺的樣品中生長產(chǎn)生的酸度和形成的光密度來測定煙酸和煙酰胺的含量。 10 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級水。 10.1 硫酸溶液 A（10 mol/L）：將質(zhì)量分數(shù)為 95 %98 %的濃硫酸 560 mL 緩慢加入到 600 mL 水中，邊加邊攪拌，冷卻后定容至 1000 mL。 GB 5413.152010 4 10.2 硫酸溶液 B（1 mol/L）：吸取 100 mL 10 mol/L 的硫酸溶液 A（10.1），轉(zhuǎn)移至 1000 mL 容量瓶用水定容。 10.3 氫氧化鈉溶液 A（3.75 mol/L）：稱取 150 g 氫氧化鈉于 1000 mL 燒杯中，用 400 mL 水溶解，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至 1000 mL 容量瓶中，用水定容。 10.4 氫氧化鈉溶液 B（0.375 mol/L）：吸取 100 mL 氫氧化鈉溶液 A（10.3）轉(zhuǎn)移至 1000 mL 容量瓶用水定容。 10.5 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.1 mol/L 0.0002 mol/L）：稱取 4g（精確至 0.0001 g）氫氧化鈉用水稀釋至 1000 mL，用鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定。保存此溶液的容器要密封，以防二氧化碳滲透。 10.5.1 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定：稱取約 0.18 g（精確至 0.0001 g）于 105 110 烘至恒重的鄰苯二甲酸氫鉀，用 50 mL 除二氧化碳的水溶于錐形瓶中，加兩滴 5 g/L 的酚酞指示劑，用配好的氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色，同時作空白實驗。氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為： c=2042. 0)(m21VV(3) 式中： c氫氧化鈉的濃度，單位為摩爾每升（mol/L） ； m鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量，單位為克（g） ； V1氫氧化鈉溶液的用量，單位為毫升（mL） ； V2空白試驗氫氧化鈉溶液的用量，單位為毫升（mL） 。 10.5.2 酚酞溶液：稱取 0.5 g 酚酞溶于 75 mL 體積分數(shù)為 95 %的乙醇中，并加入 20mL 水，加入氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（10.5），直至加入一滴立即變成粉紅色，再加入水定容至 100 mL。 10.6 鹽酸（0.1 mol/L）：吸取 8.3 mL 鹽酸，用水稀釋至 1000 mL。 10.7 乙醇溶液：體積分數(shù)為 25 %。量取 250 mL 無水乙醇，加入 750 mL 水，混勻。 10.8 菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ATCC 8014。 10.9 培養(yǎng)基（或可使用商品化的合成培養(yǎng)基） 10.9.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：光解胨 15 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀 2 g，聚山梨糖單油酸酯 1 g，瓊脂 10 g，加蒸餾水至 1000 mL，pH6.8 0.2（20 25 ）。 121高壓滅菌 15min，備用。 10.9.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：光解胨 15g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀 2 g，聚山梨糖單油酸酯 1 g，加蒸餾水至 1000 mL，pH 6.8 0.2（20 25 ）。121高壓滅菌 15min，備用。 10.9.3 煙酸測定用培養(yǎng)基：維生素測定用 Casamino Acids 12 g，葡萄糖 40 g，乙酸鈉 20 g，L-胱氨酸0.4 g，DL-色氨酸 0.2 g，鹽酸腺嘌呤 20 mg，鹽酸鳥嘌呤 20 mg，尿嘧啶 20 mg，鹽酸硫胺素 200 g，泛酸鈣 200 g，鹽酸吡哆醇 400 g，核黃素 400 g，p-氨基苯甲酸 100 g，生物素 0.8 g，磷酸氫二鉀1 g，磷酸二氫鉀 1 g，硫酸鎂 0.4 g，氯化鈉 20 mg，硫酸亞鐵 20 mg，硫酸錳 20 mg。加蒸餾水至 1000 mL，調(diào) pH 至 6.7 0.2（20 25 ）。 10.10 標(biāo)準(zhǔn)溶液 GB 5413.152010 5 10.10.1 煙酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液 （100 g/mL） ： 在五氧化二磷干燥器中取出已干燥的煙酸標(biāo)準(zhǔn)品， 稱取 50.0 mg (精確至 0.1 mg)，用乙醇溶液（10.7）溶解并定容至 500 mL，2 4 冰箱冷藏，保存期為 4 個月。 10.10.2 煙酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（10 g/mL）：從煙酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（10.10.1）中吸取 10 mL 至 100 mL 容量瓶，用乙醇溶液（10.7）定容，2 4 冰箱冷藏，保存期為 1 個月。 10.10.3 煙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液 （100 ng/mL） ： 從標(biāo)準(zhǔn)中間液 （10.10.2） 中吸取 5.0 mL， 用水稀釋至 500 mL。臨用前配制。 10.11 0.9 %生理鹽水：稱 0.9 g 氯化鈉于 100 mL 容量瓶中，稀釋至刻度，振蕩溶解。分裝于具塞試管中，每管 10 mL，121 滅菌 15 min，每周準(zhǔn)備一次。 10.12 溴麝香草酚藍指示劑：稱取 0.1 g 溴麝香草酚藍于研缽中，加入 1.6 mL 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（10.5）研磨，加少許水至完全溶解，轉(zhuǎn)移至 250 mL 容量瓶中用水定容。 11 儀器和設(shè)備 11.1 分光光度儀。 11.2 pH 計：精度為 0.01。 11.3 渦旋振蕩器。 11.4 天平：感量為 0.1 mg。 11.5 生化培養(yǎng)箱：36 1 。 11.6 離心機：轉(zhuǎn)速2000 轉(zhuǎn)/分鐘。 11.7 滴定管：分刻度值為 0.1 mL。 12 分析步驟 12.1 測試菌液的制備 12.1.1 把植物乳桿菌 （Lactobacillus plantarum） ATCC 8014 凍干菌粉轉(zhuǎn)入乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基 （10.9.2）試管中，36 1培養(yǎng) 24 h，轉(zhuǎn)接至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（10.9.1）試管中，36 1 再培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)好的乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（10.9.1）試管的培養(yǎng)物作為貯備菌種。 12.1.2 從貯備菌種培養(yǎng)基上分別轉(zhuǎn)接到三個乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（10.9.1）試管中，放入培養(yǎng)箱中 36 1 培養(yǎng) 24 h。每月轉(zhuǎn)接一次，作為月接種管貯于冰箱中。每月定期從月接種管中重新接種 3 個轉(zhuǎn)接管保存新菌株。 12.1.3 從月接種的培養(yǎng)管中的一支再接種一支乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（10.9.1）試管，36 1 培養(yǎng)24 h，作為日接種管每日測定用。 12.1.4 從日接種管中接種一管乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（10.9.2），36 1 培養(yǎng) 24 h。在無菌條件下離心該培養(yǎng)液 10 min（2000 轉(zhuǎn)/分鐘），棄去上清液。用 10 mL 生理鹽水（10.11）振蕩洗滌菌體，離心10 min（2000 轉(zhuǎn)/分鐘），棄去上清液，再加入 10 mL 生理鹽水（10.11）振蕩清洗。如前離心操作，棄去上清液。再加 10 mL 生理鹽水（10.11），混勻。吸取適量該菌懸液于 10 mL 生理鹽水（10.11）中，混勻制成測試菌液。 12.1.5 以生理鹽水（10.11）做對照，用分光光度計于 550 nm 波長下，測測試菌液（12.1.4）的透光率，此值應(yīng)在 60 %80 %之間。 GB 5413.152010 6 12.2 試樣的制備 稱取 2 g（精確至 0.0001 g）固態(tài)試樣或 5 g（精確至 0.0001 g）液態(tài)試樣（約含煙酸 0.1 mg）于 250 mL 三角燒瓶中，加 20 mL 的硫酸溶液 B（10.2）溶解試樣，放入高壓滅菌釜中 121 保持 30 min，取出冷卻至室溫。 用氫氧化鈉溶液 A （10.3） 和氫氧化鈉溶液 B （10.4） 調(diào) pH 至 6.06.5， 再用鹽酸 （10.6） ，調(diào) pH 至 4.5 0.1，用水定容至 100 mL，過濾。吸取 25 mL 濾液于 100 mL 燒杯中，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（10.5）調(diào) pH 至 6.8 0.1，轉(zhuǎn)入 250 mL 容量瓶中定容。 12.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制作 按表 1 順序加入蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)溶液和培養(yǎng)基于試管中，表 1 中每一編號需制作 3 管。試管 S2 至 S7中，相當(dāng)煙酸含量為 0 ng、100 ng、200 ng、300 ng、400 ng、500 ng。 表 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制作 試管號 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 蒸餾水（mL） 5 5 4 3 2 1 0 標(biāo)準(zhǔn)溶液（mL） 0 0 1 2 3 4 5 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 5 5 5 12.4 試樣管的制作 按表 2 順序加入蒸餾水、試樣和培養(yǎng)基于試管中，表中每一編號需制作 3 管。 表 2 試樣管的制作 試管號 1 2 3 4 蒸餾水（mL） 4 3 2 1 樣 品（mL） 1 2 3 4 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 12.5 滅菌 將標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管 121 滅菌 5 min，迅速冷卻到室溫（商品化培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進行滅菌)。 注：保證加熱和冷卻過程中條件均勻，滅菌管數(shù)過多或距離太近，在滅菌鍋中都可產(chǎn)生不良影響。 12.6 接種 在無菌條件下，向上述每管中各加入一滴（約 50 L）測試菌液（12.1.4） ，加蓋，充分振蕩混勻所有試管（標(biāo)準(zhǔn)曲線未接種空白管 S1 除外） 。 12.7 培養(yǎng) 12.7.1 酸度法：在 36 1 ，培養(yǎng) 72 h。通過對每個試管的目測檢查，未接種試管內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管中培養(yǎng)液的濁度應(yīng)有梯度。未接種管若混濁，則測定無效。 12.7.2 光密度法：在 36 1 ，培養(yǎng) 16 h24 h。其他同 12.7.1。 12.8 測定 12.8.1 酸度法 12.8.1.1 用 10 mL 水將未接種空白管 S1 和接種空白管 S2 的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至三角燒瓶中，以溴麝香草酚藍（10.12）作指示劑，或用 pH 計以 pH 6.8 0.2 為滴定終點用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（10.5）滴定標(biāo)準(zhǔn)曲線未接種空白管 S 1 和接種空白管 S 2。記錄下消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積。 GB 5413.152010 7 注：如果接種空白滴定反應(yīng)消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積數(shù)等于或高于未接種空白水平的1.5 mL，則測定結(jié)果無效。 12.8.1.2 用 10 mL 水將標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至三角燒瓶中，以溴麝香草酚藍（10.12）作指示劑，或用 pH 計以 pH 6.8 0.2 為滴定終點用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（10.5）滴定標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管的培養(yǎng)物。記錄下消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積。 注：通常標(biāo)準(zhǔn)曲線管 S7 消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積數(shù)在 8 mL12 mL 之間。 12.8.2 光密度法 以接種空白管 （表 1