2011葉綠體色素的提取分離及其理化性質(zhì).ppt

葉綠體色素的提取分離及其理化性質(zhì)的觀察,2011.3,一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?因此，測(cè)定葉綠素含量便成為研究光合作用與氮代謝必不可少的手段，在生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用。 1. 學(xué)習(xí)葉綠體色素的提取方法。 2. 了解葉綠素和類胡蘿卜素的一些主要理化性質(zhì)。,綠色植物的光合作用是在葉綠體色素參與下進(jìn)行的，了解葉綠體色素的組成、性質(zhì)及測(cè)定對(duì)于理解光合作用的本質(zhì)很有幫助。,植物色素包括： 脂溶性的葉綠體色素： 存在于葉綠體，與光合作用有關(guān)，如葉綠素、類胡蘿卜素等； 水溶性的細(xì)胞液色素： 存在于液泡中，與花朵的顏色有關(guān)，如花青素屬黃酮類物質(zhì)。,二、原理與操作步驟,（二）葉綠體色素的提取原理和方法,各種植物葉綠體中所含的色素有數(shù)十種，可分三大類。葉綠素類、類胡蘿卜素類和藻色素類（或稱藻膽素類）。后一類只存在于藻類。以下只介紹前兩類。,(一).實(shí)驗(yàn)材料：菠菜葉片。,葉綠體中含有綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b，酯類化合物）和黃色素（包括胡蘿卜素（烴類）葉黃素（衍生的醇類）兩大類。它們與類囊體膜上的蛋白質(zhì)相結(jié)合，而成為色素蛋白復(fù)合體，不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇或丙酮等有機(jī)溶劑提取。,提取的操作步驟：,乙醇提取液： （1）取菠菜葉片洗凈、擦干、剪碎、混勻，稱2g，放入研缽中。 （2）加入少量石英砂及碳酸鈣粉，加12滴管95%乙醇，研磨至糊狀；再加1015ml 95%乙醇，提取13min，過濾于三角瓶中；殘?jiān)?ml 95%乙醇沖洗，一同過濾于三角瓶中。,提取的操作步驟：,水研磨勻槳： 另取2g剪碎的新鮮葉片，放入少量石英砂（不加碳酸鈣粉），用水研磨。先加2ml蒸餾水，研至糊狀，再加蒸餾水20ml，攪均，不過濾。 為做光破壞準(zhǔn)備的,因吸附劑（本試驗(yàn)為濾紙）對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同，當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩苿?dòng)時(shí)，混合物中各成分在兩相（流動(dòng)相和固定相）間具有不同的分配系數(shù)，所以它們的移動(dòng)速度不同，經(jīng)過一定時(shí)間層析后，便將混合色素分離。,1.提取液中各成分分離：,用色層分析的原理加以分離,分配系數(shù),吸附 脫吸附 再吸附 再脫吸附,葉綠體色素的結(jié)構(gòu)決定極性不同，因而在濾紙上的遷移速率不同。,葉綠素的化學(xué)結(jié)構(gòu),細(xì)菌葉綠素a,葉綠素a,葉綠素b,卟啉,植醇 葉綠醇,烴類,衍生的醇類,吸附劑：濾紙 推動(dòng)劑：石油醚:丙酮:苯（10:2:1）,步驟： （1）圓形定性濾紙1張（直徑11cm），用細(xì)頭的吸管在其中 心戳一圓形小孔（直徑約3mm）。 （2）另取一張濾紙條（5cm1.5cm），沿紙條長(zhǎng)度方向涂色 素，限制在0.5cm，風(fēng)干后，重復(fù)涂抹數(shù)次。 沿長(zhǎng)度方向卷成紙捻。 涂抹色素要適量，量多拖尾，量少色帶看不清。 涂抹色素的技巧方法：將色素放到一塊平板玻璃上，涂 抹紙片，這樣涂抹的色帶窄，分離效果好。 （3）紙捻帶有色素的一端插入圓形濾紙的小孔中，色素一 端與濾紙平齊（勿凸出）。,（4）康維皿放置培養(yǎng)皿內(nèi)，康維皿中央小室中加滿 推動(dòng)劑。 （5）把帶有紙捻的圓形濾紙平放在康維皿上，使紙 捻下端浸入推動(dòng)劑中。蓋好培養(yǎng)皿(為什么？)。 （6）推動(dòng)劑到達(dá)濾紙邊緣時(shí)，取出濾紙，風(fēng)干。 用鉛筆標(biāo)出各種色素的位置和名稱。 （7）剪下一部分附到實(shí)驗(yàn)報(bào)告中。,注意： 1、色素多涂抹幾次，風(fēng)干后再涂抹第二次。 細(xì)，勻，直，濃。 2、涂抹的色素要適量，量多易發(fā)生拖尾，量少色帶看 不清； 3、紙捻卷緊； 4、色素涂抹的寬度不要超過紙條的二分之一； 5、中心孔要小而圓；平齊，勿突出； 6、分離時(shí)一定要蓋嚴(yán)，防止推動(dòng)劑蒸發(fā)。,顏色從外往內(nèi)分別是橙黃色、黃色、藍(lán)綠色和黃綠色。 分別為：？,實(shí)驗(yàn)結(jié)果：,標(biāo)出各種色素名稱,（1）.光對(duì)葉綠素的破壞作用,葉綠素（a，b）的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強(qiáng)光的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。 （提取出葉綠素后先做這一步）,用15N研究燕麥葉片中色素的合成和分解發(fā)現(xiàn)，72小時(shí)全部更新一遍。,2.葉綠體色素的理化性質(zhì),光對(duì)葉綠素破壞的操作步驟： 稀釋時(shí)不用嚴(yán)格定量？ 稀釋2-3倍，為什么要稀釋？,水提取液 暗 光,乙醇提取液 暗 光,注意：色素乙醇提取液的濃度太大，必須進(jìn)行稀釋才能做光破壞實(shí)驗(yàn)，稀釋倍數(shù)視提取液的濃度確定，濃度不要過大，否則在短時(shí)間之內(nèi)效果不明顯。,光下破壞的時(shí)間不要過長(zhǎng)，否則看不到效果。陰天可以適當(dāng)延長(zhǎng)，時(shí)刻觀察。 陰天和晚上上課的同學(xué)取濾紙一張，將兩種液分別涂抹在濾紙上，帶回去，放在光下處理。,（2）、熒光現(xiàn)象,葉綠素的熒光: 葉綠素酒精溶液在透射光下為翠綠色，在反射光下為棕紅色。這紅光就是葉綠素受光激發(fā)后發(fā)射的熒光。 葉綠素酒精溶液的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，約達(dá)其吸收光的10左右，而鮮葉的熒光強(qiáng)度較低，只占其吸收光的0.l1。 當(dāng)熒光出現(xiàn)后，立即中斷光源，用靈敏的光學(xué)儀器還可在短時(shí)間內(nèi)看到紅色“余暉”，這是磷光。,如果提取液的濃度較低，無法觀察到熒光。,（3）、皂化作用,C32H30ONMg,COOCH3,COOC20H39,+ 2KOH,C32H30ON4Mg,COOK,COOK,+ CH3OH + C20H39OH,葉綠醇,甲醇,葉綠素是一種二羧酸-葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復(fù)雜酯，可與堿起皂化反應(yīng)，生成醇和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水，用此法可將葉綠素與類胡蘿卜素分開。,步驟： 1、加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分搖勻； 2、加入5ml苯，搖勻 ； 3、加入適量蒸餾水，沿管壁。,注意：如果分層后下部的溶液渾濁，可以劇烈搖動(dòng)，對(duì)試管加溫，溶液很快分層，絮狀物消失，溶液變得清澈透明。原因，可能是溫度較低引起的。,（4)、吸收光譜的觀察,葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學(xué)活性，表現(xiàn)出一定的吸收光譜，可用分光鏡檢查或用分光光度計(jì)精確測(cè)定 太陽光不是單一的光，當(dāng)一束陽光通過三棱鏡后，就象雨后的彩虹那樣，可分為紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫七種顏色，形成連續(xù)的可見光譜。如果在陽光與三棱鏡之間插入一支盛有葉綠素的試管，那么，在光譜中的紅光與藍(lán)紫光的部位就會(huì)出現(xiàn)很深的黑帶，表明這些光線已被葉綠素強(qiáng)烈吸收；而綠光部位沒有黑帶，也就是未被吸收。因此，葉綠素呈現(xiàn)綠色。胡蘿卜素與葉黃素主要吸收藍(lán)紫光，基本上不吸收黃光，從而呈現(xiàn)黃色。,(5)、H+和Cu2+對(duì)葉綠素分子中 Mg2+的取代作用,H+,Cu2+,葉綠素中的可Mg2+被H+所取代而成褐色的去鎂葉綠素，后者遇銅則成為綠色的銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞，故常用此法制作綠色多汁植物的浸漬標(biāo)本。,1小試管,步驟：,加乙醇色素提取液2ml,稀釋3倍,取出1/3放到2（CK1）,加5