DNA的提取原理及提取技術(shù).ppt

,DNA的提取原理及提取技術(shù),天然DNA的來源：,1 染色體DNA 原核生物和真核生物均含有染色體DNA,它是分離目的基因和基因表達(dá)調(diào)控因子的主要材料。 2 病毒和噬菌體DNA 主要用于構(gòu)建基因克隆載體，也可作為分離目的基因和基因表達(dá)調(diào)控因子的材料。,3 質(zhì)粒DNA 很多微生物（大腸桿菌、農(nóng)桿菌和藍(lán)細(xì)菌）都含有質(zhì)粒DNA，主要用于構(gòu)建基因克隆載體，也可作為分離目的基因和基因表達(dá)調(diào)控因子的材料。 4 線粒體和葉綠體DNA 這是真核生物特有的染色體外遺傳物質(zhì)，分別含有與呼吸作用和光和作用相關(guān)的基因。主要用于分離目的基因。,植物細(xì)胞的化學(xué)成分主要有:,1 水、糖類、蛋白質(zhì)、脂肪以及核酸是生物體所需的基本成分； 2 氨基酸是合成蛋白質(zhì)的基本原料； 3 果膠、纖維素、半纖維素是植物細(xì)胞壁的組成成分； 4 淀粉是光合作用的產(chǎn)物； 5 金屬離子主要用來調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透平衡等，比如鉀和鈉，鎂和錳是葉綠素的成分。,植物總DNA提取原則,保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性 排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染 蛋白質(zhì)、多糖、酚類等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染,植物DNA提取的基本原理,DNA特點(diǎn)： DNA是極性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。 在酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。 DNP在鹽溶液中的溶解度隨著鹽濃度的增加而增加。,植物DNA提取的基本原理,DNA提取基本步驟： 1 細(xì)胞裂解和DNA的溶解 主要任務(wù)：破碎細(xì)胞并對DNA實(shí)施保護(hù)。 采取措施： 利用液氮研磨，使酶失活； 快速加入緩沖液并迅速混勻，對細(xì)胞溶漿中DNA進(jìn)行保護(hù)。,EDTA螯合DNA酶的輔助因子Mg2+和Ca2+,使DNA酶活性降低； SDS使蛋白質(zhì)變性并降解蛋白質(zhì)，也可降低DNA酶的活性； 抗氧化劑降低酚類氧化對DNA的干擾； PVP與多酚形成復(fù)雜的聚合體，與多糖結(jié)合，有效去除多糖； 。,植物DNA提取的基本原理,2 與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及RNA等雜質(zhì)的去除； 主要利用DNA與蛋白質(zhì)、多糖等在生化性質(zhì)上的差別，通過加入離子變性劑，去污劑使蛋白質(zhì)或多糖變性，核蛋白解聚。 CTAB SDS,除蛋白質(zhì),氯仿/異戊醇抽提（氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離；異戊醇則有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的氣泡）。 使用變性劑變性 （SDS、異硫氰酸胍等） 高鹽洗滌(當(dāng)溶液中的中性鹽的濃度大于1mol/L 時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)沉淀析出 .) 蛋白酶處理,除多糖,高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。 用多糖水解酶將多糖降解。 在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。,除酚類物質(zhì),在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基 乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合,除各種離子 70的乙醇洗滌 注意： 我們在提取某種植物DNA時(shí)，需要考慮以上各種雜質(zhì)的存在，根據(jù)某種植物DNA的具體情況采取相應(yīng)的去除雜質(zhì)的方法。,植物DNA提取的基本原理,3 DNA的沉淀和純化 沉淀：無水乙醇 TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA. pH8.0） 作用： TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制 DNase PH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解,DNA的純化技術(shù),瓊脂糖凝膠電泳洗脫法 主要用于小劑量DNA的純化和酶切片段的回收。 1 DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳分帶后，切取含有待純化DNA帶的瓊脂糖凝膠電泳塊，裝入透析袋中； 2 透析袋中加入適量經(jīng)稀釋的電泳緩沖液，并置于稀釋的電泳緩沖液中電泳1-2h，使DNA脫離瓊脂糖凝膠；,DNA的純化技術(shù),瓊脂糖凝膠電泳洗脫法 3 再反向電泳30s-1min，使附著在透析袋膜上的DNA重新進(jìn)入緩沖液中； 4 吸取透析袋中的洗脫液置于離心管中，以10000r/min離心5min,轉(zhuǎn)移上清液到另一個(gè)離心管中，加入3M NaAc，再加入2體積無水乙醇，-20放置1.5min以上；,DNA的純化技術(shù),瓊脂糖凝膠電泳洗脫法 5 4 ，12000 r/min離心20min，棄上清，沉淀在空氣中晾干，溶于TE中，-20保存?zhèn)溆谩?DNA提取技術(shù),一、染色體DNA的提取 CTAB法 （hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨） SDS法 （十二烷基磺酸鈉，Sodium dodecyl sulfate, 簡稱SDS）,二、非染色體DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 堿裂解法 煮沸法 線粒體、葉綠體DNA的提取 差速離心結(jié)合SDS裂解法,CTAB法（植物DNA提取經(jīng)典方法）,原理： CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。,該復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽的濃度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）時(shí)從溶液中沉淀。 通過離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。,CTAB提取緩沖液的配方,Tris-HCl （pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； Tris (三羥甲基氨基甲烷 ) EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性； NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離； -巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除,CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。,CTAB法提取植物DNA的操作步驟,1 稱取25g新鮮菠菜幼嫩組織或小麥黃花苗等植物材料，用自來水、蒸餾水先后沖洗葉面，用濾紙吸干水分備用。葉片稱重后剪成1cm長，置研缽中，經(jīng)液氮冷凍后研磨成粉末。待液氮蒸發(fā)完后，加入15mL預(yù)熱（6065）的CTAB提取緩沖液，轉(zhuǎn)入一磨口錐形瓶中，置于65水浴保溫0.51h，不時(shí)地輕輕搖動(dòng)混勻。,CTAB法提取植物DNA的操作步驟,加等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，蓋上瓶塞，溫和搖動(dòng)，使成乳狀液。 將錐形瓶中的液體倒入離心管中，在室溫下4 000r/min離心5min，靜置，離心管中出現(xiàn)3層，小心地吸取含有核酸的上層清液于量筒中，棄去中間層的細(xì)胞碎片和變性蛋白以及下層的氯仿。,CTAB法提取植物DNA的操作步驟,根據(jù)需要，上清液可用氯仿/異戊醇反復(fù)提取多次。 收集上層清液，并將其倒入離心管中。慢慢加入12倍體積預(yù)冷的70%乙醇。可看到纖維狀的沉淀（主要為DNA）。離心，即得到DNA粗制品。,CTAB法提取植物DNA的操作步驟,6 上述DNA粗制品含有一定量的RNA和其它雜質(zhì)。若要制取較純的DNA，可將粗制品溶于TE緩沖液中，加入10mg/mL的RNase溶液，使其終濃度達(dá)50g/mL，混合物于37水浴中保溫30min除去RNA。,CTAB法提取植物DNA的操作步驟,7 70乙醇沉淀DNA。最后，將DNA溶于250L 的TE緩沖液中。,CTAB法流程圖,植物材料,裂解液,上層溶液,液氮研磨,抽提,細(xì)胞裂解,干燥溶解,離心洗滌,酒精沉淀,DNA溶液,為了保證植物DNA的完整性，在吸取樣品、抽提過程中應(yīng)注意什么？,（1）整個(gè)提取過程應(yīng)在較低溫度下進(jìn)行（一般利用液氮或冰?。?；這樣可防止和抑制內(nèi)源DNase對DNA的降解； （2）當(dāng)DNA處于溶解狀態(tài)時(shí)，要盡量減弱溶液的渦旋，動(dòng)作要輕柔；在進(jìn)行DNA溶液轉(zhuǎn)移時(shí)用大口（或剪口）吸管，盡量減少對溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞。,質(zhì)粒DNA的提取 堿裂解法,原理： 在堿性條件下線狀DNA發(fā)生變性，質(zhì)粒DNA維持環(huán)狀。 在高鹽條件下作復(fù)性處理，變性的染色體DNA會(huì)形成沉淀，從而將質(zhì)粒DNA與染色體DNA分開。,質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法,染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。,溶液I （50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0） 作用：分散細(xì)胞 溶液II (0.2mol/L NaOH, 1%SDS) (SDS,十二烷基硫酸鈉） 作用：細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。 溶液III （3mol/L KAc,PH4.6） 作用：酸性下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白、線性DNA沉淀。,提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA的步驟,1 取制備好的菌液1.5ml通過離心沉淀得到的菌體懸浮于100ul預(yù)冷的溶液中，震蕩使細(xì)胞分散。 2 在冰水浴中5min后，加入200ul溶液，快速顛倒幾次，使充分混勻。此時(shí)，混合液的PH值在12.6，使細(xì)胞壁破裂，DNA變性。,3 DNA的分離抽提。 將離心管置于冰水浴中5min后，加入150mL預(yù)冷的溶液，顛倒離心管和震蕩10s，使其混勻。 置于冰水浴中5min。此時(shí)的PH值在7.0,使質(zhì)粒DNA選擇性復(fù)性，而染色體DNA隨SDS和蛋白質(zhì)一起沉淀下來。,4 4