PCR引物流程設(shè)計(jì)詳解.doc

PCR引物設(shè)計(jì)流程詳解本文目的：復(fù)制出IL-4基因片段一、 查找基因序列1、 進(jìn)入NCBI主頁(yè)，下拉選框選擇Nucleotide，在搜索欄輸入要查找的目的基因，即IL-4，點(diǎn)擊搜索2 、在搜索結(jié)果選擇靈長(zhǎng)類（Homo sapiens）2、 在靈長(zhǎng)類IL-4基因中選擇需要的mRNA序列3、 查看基因的相關(guān)信息外顯子區(qū)域CDs區(qū)域4、 點(diǎn)擊FASTA格式，并將序列保存到文檔二、 使用primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物1、 建立新文件，將所得的序列復(fù)制進(jìn)輸入框內(nèi)2、 點(diǎn)擊搜索按鈕，搜索引物3、 設(shè)置引物設(shè)計(jì)參數(shù)（因?yàn)樵谥安檎一蛐蛄械臅r(shí)候獲知，外顯子區(qū)域分別為：1-200、201-248、249-425、426-618，又知在引物設(shè)計(jì)時(shí)引物位置最好跨越一個(gè)內(nèi)含子，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度通常為100-150bp，故設(shè)定上游引物位置為201-248，下游引物位置為249-425，產(chǎn)物長(zhǎng)度為100-150bp）4、確認(rèn)條件后，顯示搜索結(jié)果4、 雙擊選中得分最高的引物查看引物情況（上圖為上游引物情況，下圖為下游引物情況）5、 將設(shè)計(jì)的上下游引物復(fù)制出來(lái)，保存到文檔中三、 使用oligo 6.0對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評(píng)價(jià)1、 建立新文件，將從cnki上獲得的cDNA復(fù)制進(jìn)輸入框，并點(diǎn)擊accept接收2、 接收后顯示出該序列的相關(guān)信息3、 點(diǎn)擊edit按鈕錄入用primer設(shè)計(jì)的上游引物，每一次輸入新數(shù)據(jù)后都需要點(diǎn)擊accept按鈕接收4、 同理，錄入下游引物5、 分析上下游引物二聚體形成情況6、 分析上下游引物發(fā)卡形成情況7、 分析上下游引物GC%8、 檢測(cè)上下游引物與PCR模板其它位置錯(cuò)配情況9、 分析PCR整體情況四、 引物特異性檢驗(yàn)（primer blast）1、 進(jìn)入NCBI主頁(yè)，并選擇blast2、 選擇primer blast3、 在輸入框內(nèi)輸入模板序列和上下游引物，并設(shè)定對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)，點(diǎn)擊get primer進(jìn)行對(duì)比4、 查看blast結(jié)果Blast 結(jié)果顯示，盡管IL