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第二章 基因工程的載體和工具酶,第一節(jié) 載體,引 言,基因克隆的本質(zhì)是使目的基因在特定的條件下得到擴(kuò)增和表達(dá)，而目的基因本身無(wú)法進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)、不易進(jìn)入受體細(xì)胞、不能穩(wěn)定維持，所以就必須借助于“載體”及其“寄主細(xì)胞”來(lái)實(shí)現(xiàn)。 作為基因克隆的載體必須具備以下特性： 載體必須是復(fù)制子。 具有合適的篩選標(biāo)記，便于重組子的篩選。 具備多克隆位點(diǎn)（MCS），便于外源基因插入。 自身分子量較小，拷貝數(shù)高。 在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高。,Characteristics of vectors for gene cloning,一、 質(zhì)粒載體 （plasimid vectors）,（一）質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性 （二）質(zhì)粒載體的制備 （三）質(zhì)粒載體的改造,（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性,（1）質(zhì)粒是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的裸露的雙鏈環(huán)狀(少數(shù)為線形和RNA） DNA分子。,廣泛從在于細(xì)菌細(xì)胞中，比病毒更簡(jiǎn)單。在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一些動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對(duì)細(xì)菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。大腸桿菌的質(zhì)粒主要有F質(zhì)粒（F因子）、R質(zhì)粒（抗藥性因子）和Col質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）三種。,（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性,（2）質(zhì)粒的大小差異很大，最小的只有1kb,只能編碼中等大小的2-3種蛋白質(zhì)分子，最大的達(dá)到200kb。 （3）質(zhì)粒的生存在寄主細(xì)胞中“友好”地“借居”，離開(kāi)了寄主它本身無(wú)法復(fù)制；同時(shí)質(zhì)粒往往有宿主專一性，如大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)不一定能在其它生物細(xì)胞中繁殖。,（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性,（4）質(zhì)粒的復(fù)制類型一種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒（stigent plasmid）,拷貝數(shù)為1-3；“松弛型”質(zhì)粒（relaxed plasmid）,拷貝數(shù)為10-60。不過(guò)即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間和不同的生長(zhǎng)環(huán)境也可能有很大的變化。 （5）質(zhì)粒的不親和性 兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。載體質(zhì)粒與受體的質(zhì)粒應(yīng)是不同的不親和群。,（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性, 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移,接合型質(zhì)粒 分子量大 嚴(yán)緊型復(fù)制,非接合型質(zhì)粒 分子量小 松弛型復(fù)制,是否含有接合轉(zhuǎn)移基因,非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，不含tra基因；可以為轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒所帶動(dòng)轉(zhuǎn)移。,轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，含有tra基因；能通過(guò)結(jié)合作用從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。,在一般情況下，質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力與分子大小及復(fù)制型間有一定的相關(guān)性。現(xiàn)歸納如下：,（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性,（7）質(zhì)粒的存在形式有超螺旋、開(kāi)環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種，,（二）質(zhì)粒DNA的制備,有多種分離質(zhì)粒的方法，如堿裂解法、煮沸裂解法、層析柱過(guò)濾法等。 目前一般使用堿變性法制備質(zhì)粒DNA。這個(gè)方法主要包括培養(yǎng)收集細(xì)菌菌體，裂解細(xì)胞，將質(zhì)粒DNA與染色體DNA分開(kāi)及除去蛋白質(zhì)和RNA。,堿變性法質(zhì)粒提取的原理： 根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來(lái)的。 在pH值12.012.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性。 通過(guò)冷卻或恢復(fù)中性pH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速?gòu)?fù)性，通過(guò)離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA。,堿變性法提取質(zhì)粒的步驟： 1、取1.5毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀； 2、加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA）渦旋震蕩懸浮菌液。 3、加入200微升新配制的溶液II，（0.2M NaOH，1.0%SDS）緩緩混勻置室溫5分鐘。 4、加入150毫升冰冷的溶液III，（醋酸鉀29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸餾水至100毫升）顛倒離心管10次后，冰浴5分鐘。 5、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA。,（三）質(zhì)粒載體的改造,去掉不必要的DNA區(qū)段。 減少限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，一種酶只保留一個(gè)。（單一的限制性酶切位點(diǎn)）。 加入易于撿出的選擇性標(biāo)記基因。 對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行安全性改造，要求質(zhì)粒不能隨便 轉(zhuǎn)移。 改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列。,1、質(zhì)粒pBR322,pBR322 4363,結(jié)構(gòu)： （1）氨芐青霉素抗性基因（ampr或Apr） 3種限制酶單一識(shí)別位點(diǎn) 。 （2）四環(huán)素抗性基因（tetr或Tcr） 內(nèi)部有7種，啟動(dòng)區(qū)內(nèi)有2種限制酶單一識(shí)別位點(diǎn) 。 （3）DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）,pBR322質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)： （1）具有較小的分子量。 4363bp，2.6106Da， （2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。 （3）具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增之后,每個(gè)細(xì)胞中可累積10003000個(gè)拷貝。 （4）對(duì)多種常見(jiàn)的限制性內(nèi)切核酸酶只含有一個(gè)能切割的位點(diǎn)。,pBR322 4363,外源DNA,pBR322 4363,PstI酶切,PstI酶切,黏性末端,黏性末端,連接酶,重組子(ampstetr) 空載體(amprtetr) 插入子(ampstets),野生型的E.coli (ampstets),導(dǎo)入,涂布在含Tc的平板上,重組子轉(zhuǎn)化子(ampstetr) 空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr),影印在含Ap的平板上,空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr),因插入外源DNA而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象稱之為插入失活效應(yīng),對(duì)比兩個(gè)平板上的菌落，凡在Tc平板上生長(zhǎng)而在Ap平板上不能生長(zhǎng)的菌落則是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆，挑選陽(yáng)性克隆，分離出重組質(zhì)粒。,2、pUC質(zhì)粒載體,1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技術(shù)在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建的 結(jié)構(gòu)： （1）來(lái)自于pBR322的Ori （2）氨芐青霉素的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列發(fā)生了變化 （3） LacZ基因 編碼半乳糖酶的肽鏈即氨基末端。 （4）MCS區(qū)段,是一段用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)組成，而且每個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)在整個(gè)載體中是唯一的。,2、pUC質(zhì)粒載體,與pBR322相比， pUC質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)： （1）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù) 如pUC8為2 750bp，pUCl8為2 686bp，控制質(zhì)粒復(fù)制rop基因的缺失，平均每個(gè)細(xì)胞即可達(dá)500700個(gè)拷貝 （2）適用于組織化學(xué)法檢測(cè)重組體 通過(guò)-互補(bǔ)作用，利用菌落顏色篩選重組子。 （3）具有多克隆位點(diǎn)區(qū)段（MCS） 可以定向克隆防止載體自我連接。,-互補(bǔ) (alpha-complementation) 大腸桿菌-半乳糖苷酶 可以和其底物X-Gal 相互作用并且釋放出一種藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)該酶的-片段和-片段分開(kāi)時(shí)就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶-片段的LacZ 基因插入到載體的多克隆位點(diǎn)的側(cè)翼序列中，而在一些人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中卻只能編碼產(chǎn)生該酶的片段。這樣一來(lái)，含有功能性完整的LacZ 基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時(shí)，載體編碼的 -片段就能和寄主編碼的片段發(fā)生互補(bǔ)并具有了對(duì)底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被成為是 alpha-complementation. X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷,釋放出的藍(lán)色物質(zhì)可以將整個(gè)菌落染成藍(lán)色，非常容易辨別，如果 LacZ插入外源基因被破壞，菌落則是無(wú)色的 。,組織化學(xué)法檢測(cè)重組體,X-Gal,-半乳糖苷酶,IPTG誘導(dǎo)物,異丙基-D-硫代半乳糖苷,半乳糖,5-溴-4-氯-靛藍(lán),二、 噬菌體載體 （phage vectors）,（一）噬菌體載體 （二） M13噬菌體載體 （三）柯斯質(zhì)粒載體,1. 噬菌體的生物學(xué)特性,溶菌周期指噬菌體將DNA注入寄主細(xì)胞后很快環(huán)化，然后進(jìn)行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細(xì)胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。 溶源周期中，注入寄主細(xì)胞的噬菌體DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體上并可以隨著寄主細(xì)胞的分裂而進(jìn)行復(fù)制。 整合了一套完整的噬菌體基因組的細(xì)菌被稱為溶源性細(xì)菌。在溶源性細(xì)菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體DNA被稱為原噬菌體。,噬菌體,溫和噬菌體，具有溶源生長(zhǎng)周期和溶菌生長(zhǎng)周期,烈性噬菌體,只具有溶菌生長(zhǎng)周期,1. 噬菌體的生物學(xué)特性,2. 噬菌體的生物學(xué)特性,2. 噬菌體的生物學(xué)特性,組成：蛋白質(zhì)外殼和線狀雙鏈DNA分子組成。 DNA長(zhǎng)度為48502bp，在分子兩端各有12個(gè)堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端。當(dāng)其注入到寄主細(xì)胞中后，可以迅速通過(guò)這兩個(gè)粘性末端的互補(bǔ)作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子。上述通過(guò)粘性末端互補(bǔ)形成的雙鏈區(qū)被稱為cos位點(diǎn)（cohesive end site）.,GGGCGGCGACCT,2. 噬菌體的生物學(xué)特性,是一個(gè)溫和噬菌體 一般以溶源生長(zhǎng)進(jìn)行增殖，脅迫條件下也會(huì)進(jìn)入溶菌生長(zhǎng)周期。 復(fù)制 溶源周期隨溶源細(xì)菌染色體一起復(fù)制 溶菌周期的早期是“”復(fù)制，晚期進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制 基因組成 DNA至少包括61個(gè)基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分為噬菌體生命活動(dòng)的必須基因，另一部分約13為非必須區(qū)段。,噬菌體載體類型,置換型 （Replacement vectors） 這種載體具有兩個(gè)對(duì)應(yīng)的酶切克隆位點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段是噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。 如Charon 4 載體 克隆能力大，2025kb,插入型 （Insertion vectors ） 這種載體僅僅有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)。 如：gt10 、 gt11 克隆能力小，不到10kb,噬菌體載體的類型, Insertion vectors,Replacement vectors,置換型載體,（二）M13噬菌體,1、絲狀噬菌體M13噬菌體的生物學(xué)特性 是單鏈閉合環(huán)狀噬菌體 只能感染雄性細(xì)菌，外形成絲狀，基因組DNA長(zhǎng)約6.4kb，可分為10個(gè)區(qū)和507 bp基因間隔區(qū)（IS區(qū)），該區(qū)可以接受外源DNA的插入而不會(huì)影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用于單鏈DNA載體的重要前提。 復(fù)制與增殖（圖）,M13噬菌體的復(fù)制與增殖,“”DNA,CP,CP脫落， “”DNA復(fù)制,RFDNA,“”型復(fù)制,積累200300份,滾環(huán)復(fù)制,SSB,外溢時(shí)被包裝,M13噬菌體,2. M13噬菌體載體的構(gòu)建,這類載體的突出優(yōu)點(diǎn)在于其既可以提供單鏈DNA，也可以提供雙鏈的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段后表現(xiàn)不穩(wěn)定，在噬菌體增殖過(guò)程中容易發(fā)生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之內(nèi)，克隆300-400bp的片段十分穩(wěn)定。, 在IS區(qū)內(nèi)插入LacZ基因 在標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)組裝MCS區(qū)段 所以能通過(guò)互補(bǔ)在X-Gal/ IPTG平板上識(shí)別重組體。這類載體包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等。,（三）柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）,柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn),柯斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體，cosmid是cos site carrying plasmid的縮寫(xiě)。 柯斯質(zhì)粒的大小為4-6kb， 由3部分組成： A.多克隆位點(diǎn)區(qū) B. 含有cos位點(diǎn)的DNA區(qū) C. 復(fù)制起始位點(diǎn)和抗性標(biāo)記區(qū),pHC79,Ori,Marker,MCS,cos,DNA,（三） 柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）,柯斯質(zhì)粒載體的特性 1、具有噬菌體的特性 柯斯質(zhì)粒連接上適宜長(zhǎng)度的外源DNA后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)寄主細(xì)胞。進(jìn)入寄主細(xì)胞的DNA也能環(huán)化和復(fù)制，但是不會(huì)形成新的噬菌體顆粒，也不能發(fā)生溶菌現(xiàn)象。 2、具有質(zhì)粒載體的特性 能象質(zhì)粒一樣在寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，且?guī)в锌剐赃x擇標(biāo)記基因，有些還帶有插入失活型的多克隆位點(diǎn)，為重組體的篩選提供了方便。 3、高容量的克隆能力 cos質(zhì)粒本身很小，只有復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記和cos位點(diǎn)等構(gòu)成，所以其克隆上限可達(dá)45kb左右。不過(guò)由于包裝的限制，其克隆片段至少要達(dá)到30kb。,（三） 柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）,柯斯質(zhì)粒載體的應(yīng)用,噬菌體的位點(diǎn)特異切割體系末端酶（terminase）體系，識(shí)別兩個(gè)相距38-54kb cos位點(diǎn)，并進(jìn)行切割，后被包裝。 下面的操作中缺點(diǎn)是：cosmid自我重組、外源DNA片段串聯(lián) 后重組。,第二節(jié) 基因操作的工具酶,一、 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用 二、 DNA連接酶及其應(yīng)用 三、 DNA聚合酶及其應(yīng)用 四、 修飾性工具酶,（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) （二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類 （三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名 （四） II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 （五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng),一、 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用,由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象-20世紀(jì)60年代，Linn和Arber 發(fā)現(xiàn),(K),大腸桿菌B,大腸桿菌K,1,1,410 4,10 4,E.O.P 成斑率 efficiency of plating,外源DNA,自身DNA,（一）核酸限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：切酶。,E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 當(dāng)(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。,限制修飾的酶學(xué)系統(tǒng),酶切位點(diǎn) 不被修飾,噬菌體DNA 被切割,酶切位點(diǎn) 被修飾,基因組DNA 不被切割,最早分離出的限制內(nèi)切酶1968年，Meselson和Yuan，大腸桿菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，沒(méi)有實(shí)用價(jià)值。 首個(gè)II型限制內(nèi)切酶1970年，H.O.Smith等從Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的體外精確切割成為可能。 從此，相關(guān)研究展開(kāi)。如NEB公司的提取和克隆。目前已純化出3000種限制性內(nèi)切酶中，其中有30%是在NEB發(fā)現(xiàn)的 。 限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease ）：是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。切開(kāi)的是3，5磷酸二酯鍵。,（二）限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性,特性 1. 限制修飾活性 2. 內(nèi)切酶的蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu) 3. 限制輔助因子 4. 切割位點(diǎn) 5. 特異性切割 6. 基因克隆中,I 型 雙功能的酶 3種不同亞基 ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸 距特異性位點(diǎn)5端至少1000bp 不是（隨機(jī)） 無(wú)用,II 型 限制酶和修飾酶分開(kāi) 單一成分 Mg2+ 位于識(shí)別位點(diǎn)上 是 非常有用,III 型 雙功能酶 2種亞基 ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸 特異性位點(diǎn)3端24-26bp處 是 用處不大,（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名,1、寄主菌屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)斜體 字母的略語(yǔ)表示酶來(lái)源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichia coli 表示為Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為 Hin； 2、用一個(gè)正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind； 3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個(gè)不同的限制修飾體系，則 用羅馬數(shù)字標(biāo)出，比如Eco R I、 Hind III。,（四）II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特點(diǎn),1、識(shí)別位點(diǎn)的特異性 每種酶都有其特定的DNA識(shí)別 位點(diǎn)，通常是由48個(gè)核苷酸組成的特定序列（靶序列）。 2、識(shí)別序列的對(duì)稱性 靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱 的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。 3、切割位點(diǎn)的規(guī)范性 交錯(cuò)切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。,幾種II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn),與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個(gè)概念,粘性末端 cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過(guò)互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新環(huán)化起來(lái)。 平 末 端 Blunt end在識(shí)別序列對(duì)稱處同時(shí)切開(kāi)DNA分子兩條鏈，產(chǎn)生的平齊末端結(jié)構(gòu)。則不易于重新環(huán)化。 同裂酶 isoschizomers 能識(shí)別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來(lái)源的內(nèi)切酶。不同同裂酶對(duì)位點(diǎn)的甲基化敏感性有差別。 同尾酶 isocaudamers 識(shí)別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。如BamH I 、BclI、BglII和 Xho I 是一組同尾酶。 注 意： 由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識(shí)別。,平齊末端,帶5P端的黏性末端,帶3OH 和5P端的平末端,例如Hpa和Msp是同裂酶，識(shí)別順序都是 5C|CG G3 3G GC|C5 如果其中有5-甲基胞嘧啶，Hpa不能夠切割，MspI能切割。,經(jīng)同尾酶消化的DNA末端連接示意圖,5 XXXXGGATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAGGXXXXXX 5,BamH I,5 XXXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 5,5 XXXXAGATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGAXXXXXX 5,Bgl II,5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 5,一個(gè)限制酶單位（U）指：在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為37）下，1h內(nèi)中完全降解1 g DNA所需要的酶量。 影響酶活性的因素很多，最重要的有： DNA的純度 DNA的甲基化程度 酶切反應(yīng)的溫度（通常為37 ） DNA的分子結(jié)構(gòu) 核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液 在“非最適的”反應(yīng)條件下,有些核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別序列的特異性便會(huì)發(fā)生“松動(dòng)”，從其“正確”識(shí)別序列以外的其它位點(diǎn)切割DNA分子，這種現(xiàn)象叫星號(hào)活性。用*表示。,（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng),酶 切 反 應(yīng) 的 基 本 步 驟,電泳,紫外分析,37 1h,加反應(yīng)液,CK,M,Buffer (10X) 2.0 L ddH2O 約16.5 L DNA 0.21.0 g Enzyme 12U Volume 20.0 L,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,（一）DNA連接酶的發(fā)現(xiàn) （二） DNA連接酶作用特點(diǎn) （三） DNA連接酶的反應(yīng)條件 （四）DNA連接的策略,二、 DNA連接酶及其應(yīng)用,（一）DNA連接酶的發(fā)現(xiàn),環(huán)形DNA分子的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家相信一定有一種能連接這種 切口的酶存在。 首個(gè)DNA連接酶(ligase)1967年，大腸桿菌DNA連接酶，是大腸桿菌基因編碼 。 1970年，發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶 ， 由大腸桿菌T4噬菌體基因編碼的。,（二）DNA連接酶作用的特點(diǎn),A. 連接的兩條鏈必須分別具有自由3OH和 5P，而且這兩個(gè)基團(tuán)彼此相鄰； B. 在羥基和磷酸基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過(guò)程。,E.coli DNA連接酶 連接具互補(bǔ)堿基黏性末端(最初研究表明），現(xiàn)在研究可連接平末端；需NAD+輔助因子，活性低，不常用。 T4DNA連接酶連接具互補(bǔ)堿基黏性末端和平末端， 需ATP輔助因子，活性高，常用。,是兩條鏈因此不能將兩條單鏈連接起來(lái)或使單鏈環(huán)化起來(lái)。 OH P 是相鄰的因此不能封閉gap，只能封閉nick.,gap NO,Nick OK,DNA 連接酶連接的作用機(jī)制, E(酶)ATPEAMPppi E(酶)NADEAMPNMN EAMP DNADNAAMPE DNA上的3OH對(duì)被活化的磷原子進(jìn)行親核攻擊，形成磷酸二酯鍵，同時(shí)釋放出AMP。,（三）T4DNA連接酶連接反應(yīng)的條件,影響連接效率的因素有： A. 溫度（通常在4-15 ） B. ATP的濃度(10ML - 1ML ) C. 連接酶濃度（一般平末端大約需12U，黏性末端僅需0.1U） D. 反應(yīng)時(shí)間（通常連接過(guò)夜） E. 插入片段和載體片段的摩爾比（ 1151）,（四）T4 DNA連接酶對(duì)目的DNA片段和載體連接的一般方案,1連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。 210l體積反應(yīng)體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數(shù)為1151），補(bǔ)足ddH2O 至8l。 3輕輕混勻，稍加離心，56水浴5min后，迅速轉(zhuǎn)入冰浴。 4加入含ATP的10Buffer 1l，T4 DNA連接酶合適單位， 用ddH2O 補(bǔ)至10l，稍加離心，在適當(dāng)溫度（一般14-16）連接8-14hr。,粘性末端DNA片段的連接DNA連接酶連接法,Nick,Nick,平末端DNA片段的連接末端同聚物加尾法,3,3,5,5,3,3,5,5,DNA聚合酶和 T4DNA連接酶,平末端DNA片段的連接銜接物連接法,銜接物(linker)，也叫接頭，是有人工化學(xué)合成的一段10-12個(gè)核苷酸組成，具有有1個(gè)或幾個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。,GGATCC CCTAGG,+,BamHI切割,GATCC G,連接酶經(jīng)BamHI切割的pBR322,G CCTAG,BamHI銜接物,dsDNA,GGATCC CCTAGG,GGATCC CCTAGG,連接酶,重組DNA分子,GATCC G,G CCTAG,（一）大腸桿菌DNA聚合酶I （二）Klenow片段酶 （三）T4 DNA聚合酶 （四）逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）,三、DNA聚合酶及其應(yīng)用,（一） 大腸桿菌DNA聚合酶I （E。Coli DNA pol I） 是Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌E。Coli 細(xì)胞中分離出來(lái)的。它是一種多功能性的酶，包括 3種不同的酶活力： 5- 3聚合酶活性 （模板， 帶3OH游離基團(tuán)的引物、4dNTPs、 Mg2+ ） 雙鏈特異性的53核酸外切酶活性 35核酸外切酶活性。 從游離的雙鏈或單鏈DNA的3端降解。不過(guò)對(duì)于雙鏈的降解可被5-3的多聚活性所抑制。主要是校正作用。,CCG GGCTATCGGA,A,T,A,G,CCT,CCGATAGCCT GGCTATCGGA,CCGATAGCCT GGCTA,T,大腸桿菌DNA聚合酶I 的三種用途,A. 利用缺口轉(zhuǎn)移法制備高比活度的DNA探針 利用其5-3的外切酶活性及其聚合酶活性。 B. 用于DNA連接前的大缺口填充 利用5-3的聚合酶活性。 C. 用于DNA的序列分析 利用5-3的聚合酶活性。,大腸桿菌聚合酶I的應(yīng)用示例,缺口轉(zhuǎn)移制備探針,Pol I + Mg2+32P dNTPs,（二） Klenow片段酶,Klenow片段是大腸桿菌聚合酶 I 全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，分子量為76KD 。 酶催活性：5 3 的聚合酶活性 3 5 的核酸外切酶活性,CCGATAGCCT GGCTA,Klenow片段的主要用途（利用5 3 的聚合酶活性） 修補(bǔ)限制性酶消化DNA形成的3隱蔽末端 標(biāo)記DNA片段的末端 底物用32PdNTPs cDNA克隆中第二鏈cDNA的合成 DNA序列的測(cè)定,（三） T4DNA聚合酶,T4DNA聚合酶是 從T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來(lái)的， 酶催活性： 53的聚合酶活性 3 5 的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶強(qiáng)1001,000倍。 因此，可以綜合利用這兩種活性進(jìn)行取代合成反應(yīng)： 如果反應(yīng)體系中僅存在一種dNTP或沒(méi)有底物時(shí)，這時(shí)T4DNA聚合酶就會(huì)表現(xiàn)出3 5 外切酶活力，從雙鏈DNA的3開(kāi)始降解，直到露出底物dNTP相同的堿基。然后就在此位置發(fā)生合成和取代反應(yīng)。,CGTCGC GCAGCG,CGTCGC GCAGCG,dTTP,Mg+,CGT GCAGCG,32P dNTPs,Mg+,T4DNA聚合酶的用途,1、利用取代合成反應(yīng)制備探針 2、標(biāo)記具有平末端的或具有3隱蔽末端的DNA片段 利用較強(qiáng)的3 5 外切酶活性和 53聚合活性 3、用于DNA序列分析,（四） 逆轉(zhuǎn)錄酶Reverse transcriptase,逆轉(zhuǎn)錄酶 是一種依賴RNA的DNA聚合酶。 此酶首先是1970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。這兩個(gè)課題組的論文都發(fā)在了同一期的Nature雜