抗體庫(kù)技術(shù).ppt

5 抗體庫(kù)技術(shù),通過(guò)DNA重組技術(shù)克隆全套抗體可變區(qū)基因,并在原核系統(tǒng)表達(dá)有功能的抗體分子片段,這種全套抗體基因表達(dá)文庫(kù)稱為抗體庫(kù) -沈倍奮:重組抗體在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用 -細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志(Chin J Cell Mol Immunol)2003, 19(2):105-106,抗體庫(kù)技術(shù)的主導(dǎo)思想，是 將某種動(dòng)物的所有抗體可變區(qū)基因克隆在質(zhì)?；蚴删w中表達(dá) 利用不同的抗原篩選出攜帶特異抗體基因的克隆，從而獲得相應(yīng)的特異性抗體,基因工程抗體技術(shù)，是繼雜交瘤單克隆抗體技術(shù)以后抗體領(lǐng)域的又一次革命 “噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)“又被譽(yù)為這次革命中的革命,該技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)在于可以使人們繞過(guò)雜交瘤和免疫而建立天然全套噬菌體抗體展示文庫(kù)， 從庫(kù)中容易地篩選出任一感興趣的抗體,抗體庫(kù)技術(shù)包括的主要過(guò)程：,克隆出抗體全套可變區(qū)基因 與有關(guān)載體連接 導(dǎo)入受體菌系統(tǒng) 利用受體菌蛋白合成分泌等條件，將這些基因表達(dá)在細(xì)菌、噬菌體等表面 進(jìn)行篩選與擴(kuò)增，建立抗體庫(kù),本章內(nèi)容,5.1 初期的抗體庫(kù) 5.2 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù) 5.3 大容量抗體庫(kù) 5.4 抗體庫(kù)技術(shù)的應(yīng)用,5.1.1 背景 5.1.2 初期的抗體庫(kù),5.1 初期的抗體庫(kù),DNA重組技術(shù)的發(fā)展和抗體基因結(jié)構(gòu)的闡明，促進(jìn)了80年代初基因工程抗體的發(fā)展 基因工程抗體，極大地改善了抗體的性能和擴(kuò)展了抗體的應(yīng)用范圍,5.1.1 背景,抗體庫(kù)技術(shù)，通過(guò)DNA重組技術(shù)，克隆全套抗體可變區(qū)基因，在原核系統(tǒng)表達(dá)有功能的抗體分子片段（即抗體庫(kù)），從中篩選特異性抗體的基因。,兩項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)： PCR：用一組引物，擴(kuò)增出全套免疫球蛋白的可變區(qū)基因 以大腸桿菌(或噬菌體)直接表達(dá)有功能活性的抗體分子片段,噬菌體展示技術(shù)（phage display）應(yīng)用到抗體的表達(dá)與克隆,5.1.2 初期的抗體庫(kù),Ward 等:,大腸桿菌表達(dá)出VH段,21 /2，000個(gè)克隆 與溶酶體特異性結(jié)合的克隆,PCR擴(kuò)增出VH基因,脾細(xì)胞DNA,溶菌酶免疫小鼠,1989年 Huse 等， 在Science上發(fā)表了完整的抗體庫(kù)工作：,用逆轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù)從淋巴細(xì)胞克隆出抗體輕鏈基因庫(kù)（repertoire）和重鏈Fd段基因庫(kù) Repertoire 所有的節(jié)目,將輕鏈和重鏈基因分別組建到噬菌體表達(dá)載體中，得到輕鏈基因庫(kù)和重鏈Fd段基因庫(kù) 通過(guò)DNA重組技術(shù)將輕鏈基因和Fd段基因隨機(jī)配對(duì)重組于一個(gè)表達(dá)載體中，形成組合抗體（基因）庫(kù) P109,感染大腸桿菌，噬菌體形成噬菌斑 相應(yīng)噬菌體載體上的鏈基因和Fd段基因得到表達(dá)，形成有功能的Fab段，釋放于噬菌斑內(nèi),將噬菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上 用標(biāo)記的抗原篩選產(chǎn)生特異性抗體的克隆，得到其Fab段的基因， 建立了完整的抗體庫(kù)技術(shù),較細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)的優(yōu)越性：,1. 省去了細(xì)胞融合的步驟 2. 擴(kuò)大了容量， 106 以上個(gè)克隆 3. 直接得到抗體的基因，不丟失，便于進(jìn)一步構(gòu)建抗體 4. 利用原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì) 5.可制備難于制備的抗體,5.2 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù),噬菌體展示技術(shù) （phage display technology）的應(yīng)用,5.2.1 噬菌體展示技術(shù),將肽段的基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中 與噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白 呈現(xiàn)于噬菌體表面,特點(diǎn)：將特定分子的基因型和表型 統(tǒng)一在同一病毒顆粒內(nèi),5.2.1.1絲狀噬菌體,M13 fd f1,復(fù)制型DNA被用來(lái)做基因克隆的載體 基因組為單鏈環(huán)狀DNA 基因中有一段基因間隔區(qū)（intragenic region）,含有病毒合成的起始和終止信號(hào)，以及子代噬菌體生成組裝的信號(hào),基因組共編碼10種蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白和DNA 合成和子代噬菌體的包裝釋放所需蛋白 管狀蛋白外殼，蛋白（2 700-3 000個(gè)）， 蛋白質(zhì) 和，蛋白質(zhì)和,噬菌體對(duì)大腸桿菌的感染：,1.通過(guò)蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)菌表面性菌毛的識(shí)別感染細(xì)菌 2.感染后其基因組DNA 進(jìn)入細(xì)菌 3.DNA 轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA 4.在噬菌體蛋白的作用下，復(fù)制大量單鏈DNA 5.與細(xì)胞膜上的噬菌體外殼蛋白組裝成完整噬菌體。,用于噬菌體展示的基因和蛋白,蛋白：50個(gè)氨基酸，中央一段疏水，可先鑲嵌在細(xì)菌內(nèi)膜上；可多價(jià)表達(dá)。 當(dāng)外源蛋白的基因與基因融合，就會(huì)在噬菌體表面表達(dá),蛋白：406個(gè)氨基酸，在感染的細(xì)菌內(nèi)，羧基端固定在內(nèi)膜上，氨基端朝向質(zhì)周腔 每個(gè)噬菌體有3-5個(gè)副本，氨基端與大腸桿菌的性毛結(jié)合，介導(dǎo)感染；羧基端與子代噬菌體的釋放有關(guān) 可低價(jià)表達(dá)外源蛋白，有利于高親和性配體的篩選,5.2.1.2 噬菌體展示技術(shù)的選擇功能,篩選過(guò)程：,Propagation 增殖,優(yōu)越性： 簡(jiǎn)便易行 篩選能力強(qiáng) 可直接得到特異克隆編碼DNA,5.2.2 噬菌體抗體庫(kù),將多樣性可變基因組裝到表達(dá)載體內(nèi)，表達(dá)到噬菌體表面得到多樣性噬菌體抗體的集合，即噬菌體抗體庫(kù)（phage antibody library） 通過(guò)吸附-洗脫-擴(kuò)增的富集過(guò)程，可有效地從噬菌體抗體庫(kù)中篩選到特異性抗體的可變區(qū)基因,5.2.2.1 噬菌體抗體,1. 噬菌體抗體表達(dá)的分子片段 表達(dá) Fab時(shí)，將輕鏈基因和Fd基因組合在同一個(gè)表達(dá)載體內(nèi)，或不同載體導(dǎo)入同一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，一個(gè)基因與外殼蛋白形成的融合蛋白鏈固定在細(xì)胞內(nèi)膜上，另一鏈分泌到質(zhì)周腔，二者可形成有活性的抗體,表達(dá)ScFv時(shí)，通過(guò)重疊延伸拼接法（replicing overlap extension, ROE）用PCR直接將輕鏈和重鏈可變區(qū)基因組合在一起；構(gòu)建ScFv時(shí)用可變區(qū)3端做引物，不受重鏈同種型的限制，有更好的多樣性。,重疊延伸PCR技術(shù)(gene splicing by overlap extension PCR,簡(jiǎn)稱SOE PCR)由于采用具有互補(bǔ)末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸,將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái). 此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進(jìn)行有效的基因重組,而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理,表達(dá)dsFV： 將可變區(qū)與基因融合，可在噬菌體表面表達(dá)出dsFv,表達(dá) Diabody:與基因融合，可在噬菌體表面表達(dá)出雙鏈抗體,2. 噬菌體抗體的表達(dá)載體 絲狀噬菌體載體 將抗體基因克隆在基因5端前導(dǎo)序列的下游，融合蛋白可表達(dá),噬粒為基礎(chǔ)載體 質(zhì)粒含有絲狀噬菌體基因間隔區(qū) 在絲狀噬菌體蛋白存在時(shí)，介導(dǎo)噬菌體DNA的復(fù)制、包裝和釋放，產(chǎn)生子代噬菌體顆粒。,噬粒 (phagemid或phasmid) 是由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體構(gòu)建成的 它們既有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn) 在大腸桿菌細(xì)胞里，可以按正常的雙鏈質(zhì)粒分子進(jìn)行復(fù)制，生成雙鏈DNA,當(dāng)宿主細(xì)胞受到輔助噬菌體感染后，噬粒載體便按單鏈?zhǔn)删w的方式進(jìn)行復(fù)制，然后由輔助噬菌體提供的外殼蛋白包裝成噬菌體顆粒 輔助噬菌體是一類自身DNA復(fù)制效率極低的突變型，但可為宿主細(xì)胞的質(zhì)粒DNA提供復(fù)制和包裝所需的蛋白酶和外殼蛋白,用輔助病毒超感染，輔助病毒提供所有的絲狀噬菌體蛋白，將噬粒DNA 以單鏈的形式包裝在噬菌體外殼蛋白內(nèi)，形成病毒顆粒，可以感染大腸桿菌，但不產(chǎn)生（輔助噬菌體）子代噬菌體。,噬粒載體中插入抗體分子片段與基因或基因 融合蛋白將嵌在細(xì)菌內(nèi)膜 輔助病毒感染細(xì)菌后 融合蛋白與野生型的蛋白或蛋白共同組裝到生成的噬菌體表面,3噬菌體抗體的價(jià) 在篩選低親和力噬菌體抗體時(shí)可選用多價(jià)的噬菌體抗體 篩選高親和力噬菌體抗體時(shí)應(yīng)選用單價(jià)的噬菌體抗體,蛋白，2 700個(gè)亞基，多于10肽會(huì)影響蛋白功能，不能用噬菌體載體表達(dá)蛋白-抗體融合分子 噬粒做表達(dá)載體，來(lái)源于輔助病毒的野生型蛋白和蛋白-抗體融合蛋白共同組裝到噬菌體表面，各自的表達(dá)數(shù)目取決于兩者的相對(duì)數(shù)量 每一個(gè)噬菌體表面可表達(dá)24個(gè)左右的抗體分子,基因(蛋白 )： 用噬菌體載體產(chǎn)生多價(jià)抗體分子 用噬粒表達(dá)，所產(chǎn)生的噬菌體抗體顆粒中10%表達(dá)有抗體分子片段，單價(jià),4 膜型和可溶性抗體分子的表達(dá) 膜型表達(dá),可溶性抗體分子的產(chǎn)生：,在表達(dá)載體中基因或的兩端設(shè)計(jì)兩個(gè)適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，以除去外殼蛋白的基因,在抗體基因和外殼蛋白基因之間設(shè)計(jì)一個(gè)琥珀密碼子（TAG）： a 在含有琥珀抑制基因的宿主菌中，可翻譯為酪氨酸、色氨酸等，表達(dá)為抗體-外殼蛋白融合分子 b 在無(wú)抑制基因的宿主菌中則UAG為終止密碼子，抗體分子表達(dá)為可溶性蛋白,5.2.2.2 抗體庫(kù)篩選技術(shù),1. 用于篩選的抗原 能夠?qū)⒔Y(jié)合與非結(jié)合形式的噬菌體分離開的方法均可用于篩選 a 可溶性抗原包被于酶標(biāo)板（聚苯乙烯） b 將抗原固定化到瓊脂糖微珠上，親和柱層析,C 生物素-抗原+ 抗體庫(kù) 生物素-抗原-抗體+ 磁珠-鏈親和素 磁珠-鏈親和素-生物素-抗原-抗體 磁場(chǎng) 特異性抗體分離,復(fù)雜抗原-細(xì)胞，可獲得與天然狀態(tài)下膜分子結(jié)合的抗體。 體內(nèi)篩選，抗體從尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，2hr后取胸腺，回收結(jié)合的噬菌體抗體。,2. 回收與篩選策略 （1）結(jié)合抗體的回收 酸堿洗脫，最常用 Genenase 酶切部位的引入,.（2）利用特異性增加回收率 減差法：P114,anti-CD55 single-chain Fv 抗原遮蔽法:：遮蔽優(yōu)勢(shì)抗原，篩選缺乏選擇優(yōu)勢(shì)的抗體 路標(biāo)選擇法（pathfinder selection） P115,（3）功能性篩選 抗體酶催化噬菌體抗體與固相基質(zhì)產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合,（4）選擇型感染 （selectively infective phage,SIP）,利用噬菌體蛋白的結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)，使只有和特定抗原結(jié)合的噬菌體抗體能感染細(xì)菌得到擴(kuò)展。 蛋白3各功能區(qū)： 氨基端N1：68Aa,與噬菌體傳入病毒有關(guān) 中間N2：131Aa,涉及與細(xì)菌表面菌毛的結(jié)合 羧基端CT：149Aa,含有穿膜錨定區(qū)，參與病毒顆粒的形成。 只有具備N1和N2的噬菌體才有充分的感染力。,原理： 構(gòu)建抗體基因-蛋白 CT基因，噬菌體不能感染細(xì)菌 抗原-蛋白 N1和N2融合蛋白 選擇性感染回收特異性抗體 P117,5.3 大容量抗體庫(kù),5.3.1 總抗體庫(kù)的容量 5.3.2 總抗體庫(kù)的多樣性 自學(xué) 相關(guān)概念： 庫(kù)容 親和力10-7-10-8/mol/L,解離常數(shù),5.4 抗體庫(kù)技術(shù)的應(yīng)用,5.4.1 制備人源抗體 5.4.1.1 從免疫后個(gè)體制備人源抗體 5.4.1.2 不經(jīng)免疫制備人源抗體,5.4.2 應(yīng)用抗體庫(kù)技術(shù)改良抗體性能 5.4.2.1 改善ScFv接頭的性能 5.4.