大鼠骨髓間充質干細胞的分離純化與成骨鑒定.doc

大鼠骨髓間充質干細胞的分離純化與成骨鑒定作者：李顯澎樊粵光劉建仁范海蛟江曉兵孫志剛曾建春陽建權【摘要】【目的】研究大鼠骨髓間充質干細胞（MSCs）的分離純化和在誘導條件下的成骨能力。【方法】取SPF級SD大鼠6只，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離成年大鼠骨髓間充質干細胞，取傳至第3代的MSCs進行細胞形態(tài)和免疫組化鑒定；應用含地塞米松、-甘油磷酸鈉和維生素C的誘導分化培養(yǎng)液誘導傳代細胞向成骨細胞分化，檢測堿性磷酸酶（ALP）的活性和細胞礦化作用進行成骨細胞鑒定?！窘Y果】全骨髓貼壁培養(yǎng)法能有效分離純化大鼠骨髓MSCs，MSCs在含體積分數(shù)為10%胎牛血清的低糖DMEM（L-DMEM）培養(yǎng)液中生長性狀相對穩(wěn)定，增殖速度快；誘導條件下，細胞ALP活性明顯增高，并出現(xiàn)了礦化結節(jié)?！窘Y論】建立了一種體外分離純化、培養(yǎng)擴增大鼠骨髓MSCs的方法，成骨能力肯定，為中藥蛋白質組學研究提供材料基礎。【關鍵詞】骨髓間充質干細胞/病理學；細胞培養(yǎng)，體外的；組織工程骨髓間充質干細胞（MSCs）在體內(nèi)外誘導因子的作用下，可向成骨細胞、成軟骨細胞、肌腱細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞和星形膠質細胞轉化，具有很大的可塑性1，這使其在組織工程、細胞治療等方面成為研究的熱點2。為更好地將MSCs應用于骨質疏松癥、骨壞死、骨缺損，本實驗通過體外細胞培養(yǎng)的方法將MSCs從骨髓中分離純化，觀察MSCs在體外的擴增、鑒定，并誘導其定向成骨分化。現(xiàn)報道如下。1材料與方法1.1動物SD大鼠6只，SPF級，體質量140160g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號為：0025033。1.2主要試劑與儀器低糖DMEM（L-DMEM，美國Gibco公司，GNM31600）；兔抗大鼠CD34（BA0532）、CD44（BA0321）、CD54（BA0541）（武漢博士德公司）；高糖DMEM（Hyclone，SH30022.01B）；胎牛血清（Hyclone，SV30087.01）；胰蛋白酶（Hyclone，SV30042.01）；-甘油磷酸鈉（美國Simga公司）；地塞米松（美國Sigma公司）；D-hanks（美國Simga公司）；維生素C（美國Sigma公司）；生物素化抗生蛋白鏈菌素復合物（streptavidinbiotincomplex，SABC）（SA1022）試劑盒（武漢博士德公司）；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）（AR1022）（武漢博士德公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。C02恒溫培養(yǎng)箱（SheldonManufactruing.Inc,modelNo:2323-2shellab，USA）；3k-15低溫離心機（美國Sigma）；DL-CJ-IF超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），MPS60倒置顯微鏡（LeikaDMIRB）；超純水系統(tǒng)（MILLPORE,SAS67120MOISHEMA,France）1.3培養(yǎng)液配制完全培養(yǎng)液：低糖DMEM（含體積分數(shù)為10胎牛血清，10g/L青霉素、鏈霉素）；誘導分化培養(yǎng)液：高糖DMEM（含體積分數(shù)10胎牛血清，10g/L青霉素、鏈霉素）中加入-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C，終濃度分別為10mmolL、10-8molL、50mol/L。1.4骨髓間充質干細胞的分離3-4取健康成年SD大鼠（150g左右），1g/L新潔爾滅浸泡30min后，斷頸處死，碘伏消毒，體積分數(shù)為75%的酒精消毒，鋪無菌單蓋住上身；無菌條件下取雙側股骨、脛骨，除去骨表面附著的軟組織，用L-DMEM浸泡清洗；用彎鉗將兩端骨骺切除，顯露骨髓腔。用10mL注射器吸取L-DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，以沖出骨髓；輕輕吹打，制成單細胞懸液；1000r/min離心20min，離心后去上清，用完全培養(yǎng)液重懸，入培養(yǎng)瓶中，用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。1.5骨髓基質干細胞的原代和傳代培養(yǎng)將上述所得細胞懸液接種于25mL塑料培養(yǎng)瓶中，置37、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。于培養(yǎng)后的第3天更換培養(yǎng)液以更新細胞代謝環(huán)境。以后每3d換液1次，去除未貼壁的細胞，待細胞匯合約80時，用2.5g/L胰蛋白酶+0.4g/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化，按1：2傳代培養(yǎng)。1.6大鼠骨髓MSCs的生長曲線測定取生長良好的第2、3代細胞（P2、P3），2.5g/L胰蛋白酶消化，1104mL接種于24孔板，每天各取3孔消化計數(shù)，每孔計數(shù)3次，連續(xù)7d。以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞數(shù)為縱坐標，描繪生長曲線（圖1）。圖1大鼠骨髓MSCs生長曲線（略）Figure1GrowthcurveofratMSCs1.7骨髓間充質干細胞的鑒定5（1）細胞形態(tài)：細胞呈梭形，邊緣清晰整齊，貼壁生長，呈成纖維細胞形態(tài)生長，呈旋渦形（圖2）。（2）免疫組化：P3培養(yǎng)3d后，去培養(yǎng)液，用40g/L多聚甲醛固定；于體積分數(shù)3%的雙氧水中室溫下放置10min；磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2min，共3次；滴加正常山羊血清，室溫10min，除去多余液體，滴加多克隆兔抗大鼠CD34、CD44、CD54，4過夜；0.01mol/LPBS洗5min，共3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37作用20min，0.01mol/LPBS洗5min共3次；滴加SABC，37作用20min，0.01mol/LPBS洗5min，共4次；DAB顯色，取1mL雙蒸水，加試劑盒A、B、C試劑各1滴，混和后加到切片，室溫顯色，鏡下控制反應時間。雙蒸水洗滌，蘇木素復染2min，時間按所需要的著色強度而定，雙蒸水洗滌3次，每次2min；放入烘箱40烘干脫水，用樹膠封片，干燥后觀察。1.8骨髓間充質干細胞的誘導分化6培養(yǎng)第5代MSCs以1105個mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板（內(nèi)鋪有預處理的蓋玻片），加完全培養(yǎng)液，48h后觀察細胞融合80%后，吸去完全培養(yǎng)液。實驗組加入誘導分化培養(yǎng)液，對照組加入等量完全培養(yǎng)液，每3d換液1次。1.9成骨細胞鑒定71.9.1鈣鈷法測定堿性磷酸酶（ALP）活性將細胞接種于預先放有蓋玻片的6孔板內(nèi)，于第5天時吸取出培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，每次1min；中性福爾馬林室溫固定10min后蒸餾水沖洗3次；加入新鮮的孵育液37孵育6h，蒸餾水沖洗3次；20g/L硝酸鈷水（現(xiàn)配現(xiàn)用）溶液浸泡5min，蒸餾水沖洗3次；10g/L硫化銨水溶液作用5min，水洗，中性樹膠固定，標記，鏡下觀察。1.9.2礦化結節(jié)染色誘導10d后吸取出培養(yǎng)液，PBS清洗3次，體積分數(shù)95%的乙醇固定30min，PBS清洗3次，1g/L茜素紅染色，雙蒸水沖洗3遍，中性樹膠固定，標記，鏡下觀察。2結果與分析2.1細胞的原代培養(yǎng)培養(yǎng)的原代細胞接種72h后，出現(xiàn)較多貼壁細胞，經(jīng)沖洗和換液，去除懸浮細胞，貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)。4d后細胞開始增殖，生長良好，貼壁較均勻，倒置顯微鏡觀察活體細胞形態(tài)：MSCs呈纖維狀，梭形，有突起；約7d時，細胞匯合成片，其融合率可達到80（圖2）。2.2細胞的傳代培養(yǎng)將原代培養(yǎng)的細胞用胰蛋白酶消化并吹打制成單細胞懸液，傳代培養(yǎng)。傳至第5代，細胞密集重疊生長，梭形，呈旋渦狀。傳代的MSCs生長快慢與接種密度關系密切（圖3）。實驗發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs的生長性狀基本穩(wěn)定，二代細胞的形態(tài)、生長曲線無顯著性差異，細胞為均一的成纖維細胞樣，潛伏適應期在第12天（約24h），對數(shù)生長期為第35天（約72h），以后進入平臺期，在對數(shù)生長期，群體倍增時間34h，傳代周期約6d，每傳代1次細胞增加約2.2倍，有學者統(tǒng)計單個MSC經(jīng)20次擴增，細胞數(shù)可達81051.5106個，說明MSCs適應能力強，增殖速度快，體外擴增容易，有巨大的擴增潛能。另外，從理論上講，在體外設法誘導或用外源目的基因導入等技術，可使細胞進行對稱性有絲分裂，從而無限擴增而不分化。因此，MSCs可作為組織工程的種子細胞及細胞治療和基因治療的載體，用于疾病和損傷的治療。P3培養(yǎng)5d后，進行細胞免疫組化檢測。CD29、CD44、CD54、CD73、CD105、CD166表達陽性,而CD14、CD34、CD45表達陰性,我們選用CD44、CD34、CD54進行鑒定。圖4結果顯示在MSCs膜上呈深紅色，不透光為MSCs特性：CD44（+）、CD54（+），不表達為造血干細胞的特性：CD34（-）。2.3細胞ALP活性測定經(jīng)誘導后的細胞，堿性磷酸酶染色明顯，胞質中陽性反應呈現(xiàn)灰黑色顆粒或塊狀沉淀，ALP活性部位呈棕黑色（圖5）。2.4細胞礦化作用檢測連續(xù)培養(yǎng)10d后，細胞呈復層生長，茜素紅染色可見紅色的礦化結節(jié)顆粒，顆粒大小不均一，提示有礦化基質沉積（圖6）。圖2原代培養(yǎng)第7天時形成的MSCs集落（50）（略）Figure2FeatureofMSCsafterprimaryculturingfor7days圖3MSCs第5代呈旋渦狀（100）（略）Figure3FeaturesofMSCsaftersubculturefor5generationsa.CD34（-）b.CD44（+）c.CD54（+）圖4MSCs免疫組化鑒定結果（50）（略）Figure4MSCsfeaturedetectedbyimmunohistochemicalmethod圖5成骨誘導后第5天（堿性磷酸酶染色，100）（略）Figure5Osteoblasticidentificationafterinductionfor5days圖6成骨誘導后第10天（茜素紅染色，50）（略）Figure6Osteoblasticidentificationafterinductionfor10days3討論MSCs在骨髓中的豐度不高，約占有核細胞的0.0010.01，因此進行分離純化和體外繁殖培養(yǎng)就顯得尤為重要。研究表明4，骨髓液中的造血干細胞與基質細胞互相影響，相互作用，維持細胞生長。為此，我們采用了全骨髓結合貼壁法。早期，培養(yǎng)成分中骨髓造血干細胞對BMSCs的生長有利；待BMSCs貼壁、生長繁殖后，造血干細胞可被清除。因此，省略前期的細胞分離對骨髓MSCs的生長影響不大。許多研究表明6-8，地塞米松、-甘油磷酸鈉和維生素C是MSCs向成骨細胞分化和體外成骨的必要條件。地塞米松可促進成骨細胞分化成熟，同時提高ALP的活性，調節(jié)成骨細胞分泌胰島素樣生長因子（insulin-likegrowthfactors，IGFs），促進細胞外基質膠原合成。維生素C能促進培養(yǎng)細胞合成膠原，形成鈣化，并能調節(jié)ATP、ALP活性和非膠原基質蛋白的合成。-甘油磷酸鈉能為成骨細胞提供磷酸離子，促進生理性鈣鹽的沉積和鈣化，是MSCs發(fā)生礦化結節(jié)的必要條件。ALP是成骨細胞的功能性酶，在鈣鹽沉積中起關鍵性作用；ALP能夠水解有機磷酸酶，使局部磷酸根濃度增高，而且可以破壞鈣化抑制劑，從而啟動鈣化。因此ALP活性的提高是MSCs向成骨細胞分化的重要標志。因而人們常用細胞中該酶的活性高低來檢測成骨細胞的存在和成骨細胞的分化成熟程度。誘導分化的MSCs隨培養(yǎng)時間的延長，ALP活性逐漸增高，大量成骨細胞形成。隨著ALP活性的提高，鈣鹽沉積在膠原纖維上，形成鈣化結節(jié)。種子細胞的選擇與培養(yǎng)是骨組織工程中的基本環(huán)節(jié)，目前可作為種子細胞的來源主要有：骨、骨髓、骨膜和骨組織中的干細胞。MSCs有取材方便、安全，對供體損傷小，易于分離培養(yǎng)，體外增殖能力強等優(yōu)點，在一定條件下，可以定向誘導分化為成骨細胞9。本實驗室正準備篩選出一批對促進MSCs和其成骨分化的補腎中藥復方，擬建立用于防治骨質疏松癥、骨壞死、骨缺損中藥的蛋白質組學技術平臺，利用此平臺可將中藥復方的多組分、多靶點、多途徑作用特點與蛋白表達關聯(lián)起來，比較不同治則中藥復方的各自不同的蛋白表達靶點和對促進MSCs以及其成骨分化能力的影響；根據(jù)表達水平差異，闡明補腎中藥復方的分子作用機制?！緟⒖嘉墨I】1RingeJ，KapsC，SchmittB，eta1PorcinemesenchymalstemcellsInductionofdistinctmesenchymalcelllineagesJCellTissueRes，2002，307（3）：321.2VandammeA，VandenDesscbeT，CollenD，eta1BonemarrowstromalcellsastargetsforgenetherapyJCurrGenether，2002，2（3）：195.3郭立迭，王捷，夏冰.改良法培養(yǎng)骨髓基質干細胞向成骨細胞分化的實驗研究J.實用醫(yī)學雜志，2006,22（2）：131.4張本斯,王凡,鄧力，等.大鼠骨髓間充質干細胞的分離純化與初步鑒定J.中國組織化學與細胞化學雜志,2003,12（2）:161.5李連達,吳理茂,劉紅.大鼠骨髓間質干細胞的培養(yǎng)和生物學特征J.科學技術與工程,2003,3（6）:457.6CoelhoMJ，F(xiàn)ernandesMHHumanbonecellculturesinbiocompatibilitytestingPartll：effectofascorbicacidbetaglycerophosphateanddexamethasoneonosteoblasticdifferentiationJBiomaterials，2000，21（11）：1095.7陳東風，黎暉，周健洪,等.大鼠骨髓間充質干細胞體外誘導條件下的成骨特性J.中西醫(yī)結合學報，2004，2（5）：375.8SierraRI,SpeckerBL,JimenezF,etal.Biochemicalbonemarker