大鼠心臟中神經肽Y的Y1 受體樣免疫反應物質的定位.doc

大鼠心臟中神經肽Y的Y1受體樣免疫反應物質的定位作者：鮑嵐張平程希平張旭【關鍵詞】心臟關鍵詞:心臟；大鼠；Y1受體；神經肽Y摘要:目的為在細胞水平精確地確定神經肽Y（NPY）的Y1受體樣免疫反應物質（-LI）在大鼠心臟中的分布.方法用免疫組織化學方法對Y1受體-LI細胞進行了檢測.結果一些心肌細胞含有Y1受體-LI，可見清晰的Y1受體免疫反應性（-Ir）條紋，此類細胞在心臟呈斑點狀分布，接近外膜側和室間隔的內膜側分布較多，Y1受體-LI主要分布于心肌細胞膜、橫小管膜和小泡上；心臟內有Y1受體-LI的心內神經元，此類細胞有較長的突起，呈離散分布，與Y1受體-LI心肌細胞或血管相鄰，Y1受體-LI神經元的外膜和胞質內有較強的Y1受體-LI，尤以其突起明顯.結論NPY對心臟作用的復雜性可能與Y1受體在心臟中多種細胞的廣泛分布有關.Keywords:heart；rats；Y1receptor；neuropeptideYAbstract:AIMToaccuratelylocalizeneuropeptideY（NPY）Y1receptor（-R）-likeimmunoreactivity（-LI）inrathearts.METHODSY1-Rimmunoreactive（-Ir）cellswereexaminedwithimmunohistochemistry.RESULTSY1-R-LIwasobservedinsomecardiomyocytesofratheartswithastripe-likepatterninthecells.Thesecellswerescatteredintheheart，especiallyneartheoutermembraneoftheheartandtheinnermembraneofinterventricularseptum.Y1-R-LIwasmainlydistributedovertheplasmalemmaofthecellandTtube，andsmallvesicles.Ontheotherhand，thereweredispersedY1-R-Irintrinsicneuronswithlongprocessesintheheart，sometimesclosetomyocardialcellsorbloodvessels.HighlevelofY1-R-LIwasobservedneartheplasmalemmaandthecytoplasmofneurons，especiallyintheirprocesses.CONCLUSIONThecomplicatedeffectsofNPYontheheartmayberelatedtotheextensivedistributionofY1recep-torinvariedcellsoftheheart.0引言含神經肽Y（NPY）的神經纖維分布于整個心臟1.通常情況下，NPY與去甲腎上腺素（NA）共存于交感神經元，但大鼠心臟中約有半數的NPY神經纖維不與NA共存，而存在于心內神經元中2.根據藥理學實驗研究，NPY對心臟的作用至少通過兩種以上的受體介導，即Y1，Y2和Y3等受體3.通過受體放射自顯影方法觀察到心臟有Y1受體的結合點4，用分子原位雜交方法也觀察到人類心臟中有表達Y1受體的mRNA5.但由于已往的檢測方法對組織定位的精確性不夠，無法在細胞水平精確地確定受體的位置.本研究用針對Y1受體C末端肽片段的一種純化的抗血清6，7，用免疫組織化學方法研究大鼠心肌細胞和心內神經元Y1受體的分布.1材料和方法1.1免疫光鏡組織化學方法SD大鼠（體質量200250g）10只（本校實驗動物中心提供），戊巴比妥鈉（50mg・；kg-1，ip）麻醉，經心臟灌注37生理鹽水50mL和含40g・；L-1多聚甲醛的0.1mol・；L-1磷酸緩沖液（PB）50mL，再灌注4同樣固定液250mL，取心臟，放入4同樣固定液后固定1.5h，200g・；L-1蔗糖浸泡24h以上，用冰凍切片機（Leica，德國）切20m的心臟矢狀和冠狀切片.根據免疫組織化學方法，將切片放入針對Y1受體C末端肽片段的一種純化的兔抗血清（18000）6-8中，用生物素標記的羊抗兔血清（1200）和VectorABC盒（Vector實驗室，美國）孵育，用葡萄糖氧化酶、二甲基聯苯胺（DAB）和硫酸鎳胺加強法顯色，標記物質呈深藍色，經干燥、透明和DPX封片.在NikonMicrophot-FX顯微鏡下觀察標本，Leica圖像處理系統(tǒng)（Leica-Q570C，德國）取像，出照片.1.2免疫電鏡組織化學方法SD大鼠4只，麻醉、灌注和后固定同上，固定液為含50mL・；L-1戊二醛和40g・；L-1多聚甲醛的PB.取心臟，切50100m振動切片.免疫組織化學方法處理同上，進行常規(guī)DAB反應，標記物質呈棕色.在10g・；L-1鋨酸中處理30min，經梯度乙醇和環(huán)氧丙烷脫水后，在Epon812中浸潤，做平板包埋，聚合后在光鏡下定位，取材，在LKB超薄切片機上切片，不做鉛鈾染色，在JEOL-1200電子顯微鏡下觀察，拍照，出照片.用制備抗體用的合成的Y1受體C末端多肽片段以1mol・；L-1與Y1受體抗體預吸收24h（4）后，做以上免疫組織化學反應，以此檢驗抗血清免疫標記的特異性.2結果2.1心肌細胞大鼠心臟內一些心肌細胞可見中等強度的藍黑色著色，為Y1受體-LI（Fig1），可見清晰的Y1受體-Ir標記條紋，為心肌細胞內橫小管結構，有的與心臟內Y受體-LI血管相鄰（Fig2）.左右心房、左右心室、房間隔、室間隔和房室瓣膜上均有Y1標記-Ir心肌細胞，此類細胞在心臟呈散在的不均勻分布，近心外膜側分布較多（Fig3），尤以左心室最明顯，室間隔近心內膜的兩側分布也較多.在電鏡下可以觀察到一些心肌細胞的外膜上有精細和間斷的Y1受體-LI標記，近胞質處有顆粒樣的Y1受體-LI標記物，也可見正在內吞的有Y1受體-LI標記的小泡（Fig4）.在橫小管兩側膜上有Y1受體-LI標記（Fig5），常在相鄰的數個橫小管中同時出現，也可間隔出現.2.2神經元大鼠心臟內有較強標記的Y1受體-Ir神經元（Fig6，7），這些神經元體積小，并有多個突起，有的突起較長，此類細胞在心臟內呈離散分布，單個存在，常與Y1受體-Ir心肌細胞相鄰（Fig6）.左右心房、左右心室、房間隔和室間隔上均有此類Y1受體-Ir神經元，但在竇房結和房室結周圍未見大量的Y1受體-Ir神經元.心內神經元胞體的外膜有較深的點狀Y1受體-LI標記，其突起的外膜處也有斷續(xù)的Y1受體-LI標記，較胞體外膜多（Fig8）.胞體的胞質內有一些與Y1受體-LI標記的外膜相臨的Y1受體-Ir小泡，也有一些顆粒狀和塊狀的Y1受體-LI，神經元的胞核在胞體中占較大部分，有時在胞膜和胞核間的狹小空間內充滿了Y1受體-Ir結構.突起的胞質內有較強的Y1受體-Ir結構，有時充滿了一小段突起，有許多Y1受體-Ir小泡，另有一些顆粒狀結構.這些含Y1受體-LI的心內神經元可以與周圍的心肌細胞相臨，在心肌細胞與之相臨面可見外膜有Y1受體-LI（Fig8）；Y1受體-LI的心內神經元也可與心內血管相臨，有時與血管腔只有一層內皮細胞之隔（Fig9）.用經預吸收后的抗血清孵育組織切片，并做免疫組織化學反應后未見有以上描述的陽性結構.3討論NPY受體與心臟的變時和變力作用有關9.我們提供了Y1受體存在于心肌細胞和心內神經元的直接形態(tài)學證據.在通常情況下，Y1受體-LI心肌細胞和心內神經元呈散在的不均勻分布，靠心肌外膜側較多，左右心房、左右心室、房間隔、室間隔和房室瓣膜上均有分布.Y1受體在心臟的多種細胞和廣泛分布為NPY對大鼠心臟變時和變力作用的多樣性9提供了一定的依據.許多以往的研究顯示心臟組織有大量的NPY免疫反應陽性神經纖維，心房多于心室10.同時有研究表明心臟具有多種NPY受體，如受體放射自顯影配基結合試驗結果顯示心室膜有NPY的結合位點，用選擇性的Y2受體激動劑NPY（13-36）結合指示此為Y2受體；又如在心室肌，其NPY受體對PYY和NPY的親合性存在差別，而到目前為止Y1和Y2受體對PYY和NPY幾乎具有同樣的親合性，因此認為在心室肌的結合位點為Y3受體11.藥理學實驗也進一步證實心臟內有多種NPY受體，大鼠心肌細胞至少存在兩種接后（postjunctional）NPY受體，Y1可能介導NPY對心肌細胞的負性收縮反應12.本研究證實大鼠心肌細胞有Y1受體，但呈散在分布，未見心房內有許多Y1受體-Ir的心肌細胞，似與心臟內NPY神經纖維的密集和區(qū)域密集分布不匹配，有可能這些心肌細胞表達其他類型的NPY受體.此外，Y1受體-Ir心肌細胞散在分布于較多的Y1受體陰性心肌細胞中，NPY是如何通過具有Y1受體的心肌細胞對整體心肌產生作用尚待進一步研究.圖1圖9略在電鏡下可清晰地觀察到大鼠一些心肌細胞的外膜和橫小管膜上及胞質中有Y1受體-LI，且存在于小泡中.Y1受體為G蛋白偶聯超家族受體，NPY作用于接后Y1受體時，通過抑制性的G蛋白，可能對心肌產生負性肌力作用9，在這一過程中，均可引起細胞內鈣離子變化.通常情況下，心肌細胞經橫小管將興奮傳向終池，使肌漿網膜上的鈣泵活動，肌漿內的鈣離子濃度發(fā)生改變，從而引起心肌一系列變化13.NPY可能通過作用于心肌外膜和橫小管膜上的Y1受體，對心肌收縮力產生影響.我們的研究表明，大鼠心臟有較強的Y1受體-Ir神經元，并具有較長的突起，可能為心內神經元，心內神經元主要為迷走神經的節(jié)后神經元，可單個存在.有研究報道心內神經元中有NPY反應陽性神經元14，因此來自心內神經元自分泌或旁分泌的NPY對其自身有調節(jié)作用，也可對其周圍的心肌細胞產生作用，這也為Y1受體可以是接前（prejunctional）受體提供了新的證據.已有的研究發(fā)現大鼠心臟有一種小強熒光細胞位于心肌細胞之間，有的在有孔毛細血管周圍，可釋放兒茶酚胺或其他物質到組織間隙或血管內，以內分泌和旁分泌的方式起局部調節(jié)作用15.我們的研究發(fā)現Y1受體-LI的心內神經元可與心內血管相臨，特別是有時與血管腔只有一層內皮細胞之隔，因此Y1受體-LI的心內神經元也可能是此小強熒光細胞，NPY通過對接前Y1受體的作用，除對乙酰膽堿的釋放起調節(jié)作用外，對兒茶酚胺或其他物質的釋放也起調節(jié)作用.參考文獻:1WhartonJ，GulbenkianS.Peptidesinthemammaliancardiovas-cularsystemJ.ExperentiaSuppl，1989；56:292-316.2CorrLA，AberdeenJA，MilnerP，LincolnJ，BurnstockG.SympatheticandnonsympatheticneuropeptideY-containingnervesintheratmyocardiumandcoronaryarteriesJ.CircRes，1990；66（6）:1602-1609.3GrundemarL，HakansonR.MultipleneuropeptideYreceptorsareinvolvedincardiovascularregulation.PeripheralandcentralmechanismsJ.GenPharm，1993；24（4）:785-796.4WahlestedtC，RegunathanS，ReisDJ.IdentificationofculturedselectivelyexpressingY1-，Y2-orY3-typereceptorsforneu-ropeptideY/peptideYYJ.LifeSci，1992；50（4）:PL7-PL12.5WhartonJ，Gor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