電離輻射對人鼻咽癌細胞株CNE2Z體外表達血管內(nèi)皮生長因子的影響.doc

電離輻射對人鼻咽癌細胞株CNE2Z體外表達血管內(nèi)皮生長因子的影響【摘要】目的探討電離輻射對人鼻咽癌細胞體外表達血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的影響。方法人鼻咽癌細胞株CNE2Z置RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，實驗分為兩組，劑量梯度組分別給予2、4、6、8、12、16Gy電離輻射；時間梯度組給予6Gy照射；收集細胞上清液，雙抗體夾心ELISA法測定VEGF表達水平。結(jié)果與陰性處理細胞比較，人鼻咽癌細胞株CNE2Z體外接受不同劑量輻照后，VEGF表達明顯增高，且具有劑量依賴性和時程依賴性。結(jié)論電離輻射能誘導(dǎo)人鼻咽癌細胞VEGF高表達，這可能是臨床腫瘤抗輻射的機制之一。【關(guān)鍵詞】電離輻射；鼻咽癌細胞；血管內(nèi)皮生長因子【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectsofionizingradiation(IR)onvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)expressioninnasopharygealcarcinomacells.MethodsCNE2ZnasopharygealcarcinomacellsweremaintainedinRPMI1640mediumandexposedtoIRinincrementaldosesof2,4,6,8,12,16Gy.Thesecellswerecultureddifferenttimeafterexposure,andthemediawereharvestedformeasurementofVEGFproteinlevelsbyELISA.ResultsExposureofCNE2ZcellstoIRinducedsignificantupregulationofVEGFexpression.VEGFlevelsexhibitedanIRandtimedependentincreaseincomparisonwiththecontrolunirradiationcells.ConclusionIRmediatedinductionofVEGFinnasopharyngealcarcinomacellsmaycontributetoclinicallytumourradioresistance.【Keywords】ionizingradiation,nasopharyngealcarcinoma,VEGF鼻咽癌是我國常見的惡性腫瘤之一，放射治療是其首選的治療手段，局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移仍是治療失敗的主要原因。惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管生成，血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）是最重要的與血管生成有關(guān)的因子。在放射治療過程中，有關(guān)VEGF表達變化的研究國內(nèi)少有報道，對此，我們初步探討如下。1材料與方法1.1細胞培養(yǎng)及照射取對數(shù)生長期細胞制成1105/ml單細胞懸液，2ml/孔接種于六孔板中，待細胞貼壁后（約12h），采用Siemens直線加速器6MeVX射線，吸收劑量率2Gy/min，源皮距100cm，射野大小10cm20cm，從下向上照射。實驗分為兩組：劑量梯度組分別給予0、2、4、6、8、12、16Gy照射；時間梯度組給予6Gy照射。1.2條件培養(yǎng)液的收集劑量梯度組于照射后24h，時間梯度組于照射后0、12、24、36、48h時間點終止培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管，4，2000r/min離心5min，吸取上清液-20冷凍保存?zhèn)溆谩?.3條件培養(yǎng)液VEGF濃度的測定采用雙抗體夾心ELISA法測定細胞上清液VEGF。人VEGFELISA試劑盒購自中杉生物工程公司，具體操作按說明書進行。1.4數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)資料統(tǒng)計采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS10.0進行單因素方差分析。2結(jié)果不同劑量射線照射24h后，CNE2Z細胞VEGF的表達均增高。4Gy時最高，后隨劑量的增加有所下降，與對照組0Gy比較，差異均有顯著性（P<；005），見表1。表1不同劑量照射24h后CNE2Z細胞培養(yǎng)液中VEGF濃度略6Gy照射后，各時間點條件培養(yǎng)液中VEGF的含量逐漸升高，36h時與0h比較，差異有顯著性（P<；0.01），到48h時達最高水平,與對照組0h時比較，差異有極顯著性（P<；001），見表2。表2照射后不同時間CNE2Z細胞培養(yǎng)液中VEGF濃度6Gy照射后時間（略）3討論放射治療失敗的主要原因有腫瘤細胞的放射抵抗性、腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移等。低氧是導(dǎo)致腫瘤放射抵抗的一個重要原因2，低氧能誘導(dǎo)腫瘤細胞表達VEGF，放射也可以誘導(dǎo)VEGF的高表達3，4。腫瘤細胞產(chǎn)生的VEGF不僅以旁分泌方式刺激血管生成，而且以自分泌方式刺激腫瘤細胞自身的生長。VEGF可能在腫瘤細胞以及腫瘤血管內(nèi)皮細胞經(jīng)過放射損傷后的修復(fù)過程中發(fā)揮一定的作用5。放射治療不僅對腫瘤細胞有直接或間接殺傷作用，還具有封閉腫瘤血管的作用，可使血管內(nèi)皮細胞退化、變性。隨著腫瘤縮小，腫瘤微血管更加迂曲、變形、管腔縮小，血流緩慢，血栓形成，使腫瘤微血管進入封閉狀態(tài)6。然而，已有文獻報道，放射治療本身也可引起腫瘤血管生成活躍，VEGF分泌增加79。其機制可能是：腫瘤細胞受照射的應(yīng)激保護性反應(yīng)。電離輻射激活轉(zhuǎn)錄所需的PKC（蛋白激酶C）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，促進VEGF等多種細胞因子表達。放射治療還可以激活EGFR，通過MAPKS信號傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)TGF、VEGF等生長因子表達增加。放射治療還直接激活MAPKS，應(yīng)激相關(guān)蛋白激酶和ras相關(guān)激酶等改變細胞增殖狀態(tài)，使腫瘤細胞得以生存。放射治療促進VEGF表達和血管生成，無效的血管生成使乏氧細胞增加，乏氧細胞增加又促進血管生成，如此惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致腫瘤對放射治療產(chǎn)生抗性。Gorski等10研究證實Lewis肺癌細胞體外接受電離輻射后，VEGF的表達明顯增高，移植瘤輻射后瘤體組織VEGF增加。本文結(jié)果顯示，與未受輻射細胞比較，人鼻咽癌細胞系CNE2Z體外接受不同劑量的輻射后，VEGF的表達也明顯增高，且隨輻射劑量的增加、輻射后時間的延長，效應(yīng)越加顯著。提示電離輻射誘導(dǎo)腫瘤細胞VEGF高表達，可能是腫瘤治療過程中產(chǎn)生放射抵抗性的機制之一，推測放射治療聯(lián)合抗VEGF的抗血管生成治療可能會取得理想的抗腫瘤效應(yīng)。雖然從理論上講抗血管生成治療導(dǎo)致血管的退行性變，引起腫瘤內(nèi)的缺氧狀況，導(dǎo)致腫瘤細胞的放射抵抗性，但是大量的實驗證據(jù)已經(jīng)駁斥了這種觀點11。放射治療聯(lián)合抗血管生成治療可以有協(xié)同作用并非僅僅是相加作用。隨著抗血管生成治療與放射敏感性機制的研究深入，以及抗血管生成方法和藥物不斷發(fā)現(xiàn)，可以樂觀地預(yù)計抗血管生成在腫瘤放射治療中會日益受到重視，并成為腫瘤綜合治療的重要措施之一?！緟⒖嘉墨I】1GuptaVK,JaskowiakNT,BeckettMA,etal.VascularendothelialgrowthfactorenhancesendothelialcellsurvivalandtumorradioresistanceJ.CancerJ,2002,8(1):4754.2BrizelDM,SibleyGS,ProsnitzLR,etal.TumorhypoxiaadverselyaffectstheprognosisofcarcinomaoftheheadandneckJ.IntJRadiatOncolBiolPhys,1997,38(2):285289.3MoellerBJ,CaoY,LiCY,etal.RadiationactivatesHIF1toregulatevascularradiosensitivityintumors:Roleofreoxygenation,freeradicals,andstressgranulesJ.CancerCell,2004,5(5):429441.4SemenzaGL.Intratumoralhypoxia,radiationresistance,andHIF1J.CancerCell,2004,5(5):405406.5GengL,DonnellyE,McMahonG,etal.InhibitionofvascularendothelialgrowthfactorreceptorsignalingleadstoreversaloftumorresistancetoradiotherapyJ.CancerRes,2001,61(6):24132419.6DenisF,ColasS,ChamiL,etal,Changesintumorvascularizationafterirradiation,anthracyclin,orantiangiogenictreatmentinnitrosomethylureasinducedratmammarytumorsJ.ClinCancerRes,2003,9(12):45464552.7ParkJS,QiaoL,SuZZ,etal,Ionizingradiationmodulatesvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)expressionthroughmultiplemitogenactivatedproteinkinasedependentpathwaysJ.Oncogene,2001,20(25):32663280.8WachsbergerP,BurdR,DickerAP.Tumorresponsetoionizingradiationcombinedwithantiangiogenesisorvasculartargetingagents:exploringmechanismsofinteractionJ.ClinCancerRes,2003,9(6):19571971.9BrownCK,KhodarevNN,YuJ,etal.GlioblastomacellsblockradiationinducedprogrammedcelldeathofendothelialcellsJ.FEBSLett,2004,565(13):167170.10GorskiDH,BeckettMA,JaskowiakNT,etal.Blockadeofthevascularendothelialgrowthfactorstressresponsein