南方紅豆杉水提物對(duì)人肺癌A549 細(xì)胞增殖抑制作用的研究.doc

南方紅豆杉水提物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖/抑制作用的研究舒琦瑾1李萍2王彬彬1朱國(guó)猛1（1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤科，杭州310006；2杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，杭州310015）摘要：目的研究南方紅豆杉水提物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用和機(jī)制。方法采用MTT法檢測(cè)南方紅豆杉水提物對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用；生長(zhǎng)曲線法觀察其抑制A549細(xì)胞的時(shí)間-效應(yīng)曲線；流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)A549細(xì)胞周期及凋亡的影響；倒置顯微鏡及電鏡觀察其對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響。結(jié)果南方紅豆杉水提物對(duì)A549細(xì)胞的增殖有抑制作用；其抑制作用機(jī)制為使A549細(xì)胞周期出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)論南方紅豆杉水提物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的增殖有抑制作用。主題詞：南方紅豆杉；抑制作用；人肺癌A549細(xì)胞；細(xì)胞增殖StudyonInhibitoryActionofProliferationofhumanlungcarcinomaA549CellwithaqueousextractofTaxuschinensisShuQi-jin1,LiPing2,WangBin-bin1,ZhuGuo-meng11.DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhejiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310006,China2.DepartmentofOncology,theAffiliatedHospitalofHangzhouNormolUniversityHangzhou310015,ChinaCorresondingauthor:ShuQi-jin,E-mail:.Abstract：ObjectiveTostudytheinhibitoryeffectofaqueousextractofT.chinensisvaronvitroculturedhumanlungcarcinomaA549cell,andtoexploreitsmechanism.MethodsTheinhibitoryeffectofT.chinensisvaronhumanlungcarcinomaA549cellwastestedbyMTTmethod；time-effectrelationshipwasobservedbygrowthcurve；effectsonblockageofcellcycleandapoptosiswasinspectedbyflowcytometry；morphologyoftheA549cellwasobservedbyinversionmicroscopeandelectronmicroscope.ResultsTheaqueousextractofT.chinensisvarhasinhibitoryeffectontheproliferationofcellA549,andthemechanismrelatedtoblockingthecycleofcellA549atG0/G1periodandinducingapoptosisoftumorcell.ConclusionsTheaqueousextractofT.chinensisvarhasinhibitoryeffectontheproliferationofcellA549.Subjectwords：T.chinensisvar；inhibitoryeffect；humanlungcarcinomaA549cell紅豆杉是紅豆杉科紅豆杉屬植物總稱(chēng)，是世界上公認(rèn)的瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物。基金項(xiàng)目：浙江省自然基金項(xiàng)目（NO.Y2081051），浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（NO.2009ZA003）通訊作者：舒琦瑾，浙江省杭州市郵電路54號(hào)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤科，郵編：310006，電話傳真E-mail:本草綱目就記有紅豆杉治療霍亂、傷寒、排毒等療效，現(xiàn)代中藥大辭典、本草推陳等醫(yī)藥書(shū)中則有進(jìn)一步記載。其性味苦、平，有小毒，歸心經(jīng)，功效消腫散結(jié)，主治：腫瘤、腎病、風(fēng)濕等。目前已經(jīng)從紅豆杉中分離出400多種化合物，包括紫杉烷類(lèi)化合物和少量的非紫杉烷類(lèi)化合物1-6。水煎劑是中藥應(yīng)用的傳統(tǒng)方式及臨床應(yīng)用的主要方式，紅豆杉水煎劑已在臨床廣泛應(yīng)用,且安全有效。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)應(yīng)用紅豆杉水提物抑制腫瘤的研究報(bào)道。本課題通過(guò)對(duì)南方紅豆杉水提物的研究，驗(yàn)證其對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用，進(jìn)一步闡明南方紅豆杉水提物的抗腫瘤作用，為天然藥物南方紅豆杉的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。儀器和材料Elx808型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），BX20型熒光顯微鏡攝像機(jī)（日本OLYMPUS公司），ULTRACUTE超薄切片機(jī)（奧地利Reichert-Jung公司），JEM-1230型透射電鏡（日本JEOL公司）。南方紅豆杉：購(gòu)自浙江省中醫(yī)院中藥房，寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司生產(chǎn),規(guī)格：8g/袋。人肺腺癌細(xì)胞株A549，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。Hylcone胎牛血清（美國(guó)Thermo公司），F(xiàn)12-K培養(yǎng)液（美國(guó)GIBCO公司），MTT粉（美國(guó)Sigma公司），AnnexinV/PIapoptosiskit（美國(guó)Invitrogen公司），DNA染色劑（美國(guó)AMRESCO公司）。方法1.細(xì)胞培養(yǎng)用體積分?jǐn)?shù)為10的胎牛血清F12-K培養(yǎng)液，在37、體積分?jǐn)?shù)為5的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)均取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。2.藥物制備考文獻(xiàn)方法7，80g南方紅豆杉3次煎煮藥液經(jīng)真空抽濾器過(guò)濾，電磁爐上濃縮至約100ml，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮成約40ml藥液，入真空干燥箱中干燥，按100%濃度計(jì)算得率。取1g水提物，加入10ml超純水，溶解、離心，取上清液，再經(jīng)0.22m微孔濾膜除菌，制成母液濃度100mg/ml，置-20冰箱備用。3.MTT法收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度約5104/ml，接種于96孔板，每孔加入100L，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底，以F12-K培養(yǎng)液稀釋藥物至不同濃度，每孔加入100L，水提物濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/ml，并設(shè)空白組和陽(yáng)性對(duì)照組，每濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24小時(shí)后，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20LMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h，2000r/min離心96孔板，利用虹吸原理?xiàng)壢ヅ囵B(yǎng)液。每孔加入150L二甲基亞砜，置搖床上振蕩10min。在酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光值（OD值）。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：生長(zhǎng)抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值）100%。用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，劑量和效應(yīng)關(guān)系用藥物濃度抑制軟件（LOGIT法）版本1.0.0求半數(shù)抑制率（IC50）。4.生長(zhǎng)曲線法收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度約2104/ml，接種于96孔板，每孔加入100L，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底，以F12-K培養(yǎng)液稀釋藥物至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL,每孔加入100L,各取4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20LMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，2000r/min離心96孔板利用虹吸原理?xiàng)壢ヅ囵B(yǎng)液。每孔加入150L二甲基亞砜，置搖床上振蕩10min。在酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)藥物濃度及各孔吸光值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞用0.25%胰酶-EDTA消化，制成2105/ml細(xì)胞懸液接種于60mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，5105個(gè)/皿。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h貼壁后棄上清，加入無(wú)血清F12-K培養(yǎng)液，饑餓同步化18h后，使細(xì)胞停滯于G0期8?？瞻讓?duì)照組加入10%胎牛血清的F12-K培養(yǎng)液，藥物組設(shè)置三個(gè)濃度分別為：藥物A組：2mg/ml，藥物B組：2.5mg/ml，藥物C組：3mg/ml，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組（DDP組），給予DDP200g/ml.培養(yǎng)24h后，收集上清液細(xì)胞，0.25%胰酶-EDTA消化，1000r/m離心10min，收集貼壁細(xì)胞，1640培養(yǎng)液洗滌2次，1000r/m離心10min,加入70%冷乙醇在4固定12h,在檢測(cè)細(xì)胞凋亡的試管中先后加入1Buffer100ml，AV染液5L，PI染液1L，避光15min，再加入1Buffer400L，上機(jī)檢測(cè)；在檢測(cè)細(xì)胞周期的試管中加入1mL的DNA染色劑，避光30min，上機(jī)檢測(cè).并用隨機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。6.細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察在Olympus倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中的活細(xì)胞,并于電鏡下行超微結(jié)構(gòu)觀察。細(xì)胞經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸雙固定,梯度乙醇和丙酮脫水,Epon812樹(shù)脂包埋,超薄切片機(jī)(ULTRACUTE型)切片,行醋酸鈉和檸檬酸鉛雙重染色,在透射電鏡下觀察并拍照。結(jié)果1.MTT法藥物敏感實(shí)驗(yàn)200g/ml濃度組DDP的抑制率為70.46%，南方紅豆杉水提物作用A549細(xì)胞24h后，對(duì)A549細(xì)胞有明顯的抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，其抑制作用逐步增強(qiáng)，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。IC50為2.20mg/ml。2.南方紅豆杉水提物對(duì)A549細(xì)胞作用的生長(zhǎng)曲線的影響根據(jù)5d的MTT結(jié)果來(lái)繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果示：低濃度的水提物對(duì)A549細(xì)胞的抑制呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性。（圖1）3.南方紅豆杉水提物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞周期及凋亡的影響3.1南方紅豆杉水提物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞周期分布的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，經(jīng)藥物處理24h后的細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯，表現(xiàn)為G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞相應(yīng)減少，使其發(fā)生G1期阻滯，且隨著給藥濃度的增加，作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系（表1，圖2）。3.2.南方紅豆杉水提物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，經(jīng)藥物處理24h后的細(xì)胞早期凋亡的比例均有明顯升高，且早期凋亡的比例呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系（表2，圖3）。4.南方紅豆杉水提物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞形態(tài)的影響4.1倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化紅豆杉水提物2、2.5、3mg/ml處理A549細(xì)胞24h后，結(jié)果顯示：與正常細(xì)胞相比，隨著水提物劑量增加，A549細(xì)胞增殖受抑制，形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、壞死，呈典型凋亡表現(xiàn)（圖4-圖7）4.2電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化水提物2、2.5、3mg/ml處理A549細(xì)胞24h后，與正常細(xì)胞相比，隨著紅豆杉水提物劑量增加，A549細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，細(xì)胞核碎裂，凋亡小體形成等凋亡的典型形態(tài)學(xué)改變（圖8-圖11）。討論細(xì)胞周期分為：G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）、M期（有絲分裂期）。S期進(jìn)行染色體復(fù)制和M期將復(fù)制的染色體分配到兩個(gè)子細(xì)胞中是細(xì)胞周期的兩個(gè)基本條件。細(xì)胞分裂的精確性及定時(shí)性是正常細(xì)胞生長(zhǎng)和分化所必須，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起源于細(xì)胞周期“start”位點(diǎn)的失控，使大量G0期細(xì)胞無(wú)限制地通過(guò)G1/S和G2/M轉(zhuǎn)換，從而導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖。腫瘤細(xì)胞的增殖動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為細(xì)胞群體分布主要與DNA合成活躍的S期有關(guān)，細(xì)胞一旦進(jìn)入此期，如無(wú)特殊干擾，便能按細(xì)胞周期的順序發(fā)展下去，直至重新回到G1期。因此若在G1/S和G2/M期予以阻斷，便能有效控制腫瘤細(xì)胞周期，從而控制腫瘤增殖。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的深入，人們認(rèn)識(shí)到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不僅與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化異常有關(guān)，而且同細(xì)胞凋亡的調(diào)控失常有關(guān)。因此，設(shè)法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡已成為一種新的治療方向9。本研究表明，南方紅豆杉水提物具有一定的抑制人肺癌A549細(xì)胞增殖的作用，并呈一定的劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。南方紅豆杉水提物能夠阻止人肺癌A549細(xì)胞周期于G0/G1期，誘導(dǎo)其凋亡，為該中藥抗腫瘤作用機(jī)制之一。鑒于幾乎所有的癌基因、抑癌基因的生物學(xué)效應(yīng)最終都?xì)w結(jié)到細(xì)胞周期的機(jī)制上10，因此如何調(diào)控細(xì)胞周期以及特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為當(dāng)前腫瘤研究的特點(diǎn)。至于南方紅豆杉水提物阻滯腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的確切作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。參考文獻(xiàn)1ShlQW,KiyotaK.NewnaturaltaxanedlterpenoidsfromTaxusspeciessince1999.ChemBiodiv,2005,2:15972PannerVS,JhaA,BishKS,etal.Constituentsofyewtrees,Phytochemitry,1999,50(8):12673FarinaV.Thechemistryandpharmacologyoftaxolanditsdefivatives.AmsterDam:Elsevier,1995,22:554AppendinoG.Thephytochemistryoftheyewtree.NatProdRep,1995,12:3495GeorgGI,ChenTT,OjimaI,etal.Taxaneanticanceragents,basicscienceandcurrentstatus.WashingtonDC:AmericanChemicalSociety,1995,583:16BalogluE,KingstonDGI.Thetaxanediterpenoids.JNatprod,1999,62(10):14487李秀云.中藥房中藥店工作手冊(cè).廣州:廣東科技出版社,1991:103.8王曉華,馬萍,尹元琴,等.斑蝥素對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用的研究沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23（9）：5986009張衛(wèi)東，趙惠儒，閻影，等.斑蝥素誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制的研究中華腫瘤雜志，2005，27（6）：33033410BlagosklonnyMV，PardeeAB.Exploitingcancercellcyclingforselectiveprotectionofnormalcell.CancerRes，2001，61(11)：43014305附表1南方紅豆杉水提物對(duì)A549細(xì)胞周期的影響（s，n=3）組別G1(%)S(%)G2(%)空白對(duì)