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-本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔,如需本文,請下載-rhBMP2m在高濃度條件下的復(fù)性本文從網(wǎng)絡(luò)收集而來,上傳到平臺為了幫到更多的人,如果您需要使用本文檔,請點擊下載按鈕下載本文檔(有償下載),另外祝您生活愉快,工作順利,萬事如意!【摘要】 目的: 優(yōu)化高濃度的人骨形成蛋白2成熟肽(rhBMP2m)的復(fù)性條件. 方法 : 將工程菌株進行高密度發(fā)酵、溫度誘導(dǎo)表達,裂菌收集包涵體后經(jīng)離子交換色譜分離純化. 純化后的蛋白在不同的溫度、復(fù)性液pH, 氧化交換系統(tǒng)濃度、鹽濃度等條件下進行透析復(fù)性. 透析復(fù)性后進行非還原的SDSPAGE, 檢測rhBMP2m活性形式二聚體的含量,同時找出相對較優(yōu)的復(fù)性方法對復(fù)性產(chǎn)物進行 m微孔濾膜除菌并 計算 其損失率. 結(jié)果: 經(jīng)透析復(fù)性后rhBMP2m完全可溶,而且其活性形式二聚體的含量達到30%左右,即復(fù)性后二聚體的rhBMP2m可以達到每升發(fā)酵液800 mg,并且經(jīng)微孔濾膜除菌后rhBMP2m活性形式二聚體的含量基本沒有損失,同時蛋白定量也表明過濾除菌后蛋白損失不超過10%. 結(jié)論: 高pH有利于rhBMP2m的復(fù)性,除變性劑尿素時采用低pH可以保持高濃度rhBMP2m復(fù)性后仍保持可溶. 蛋白質(zhì)的濃度、pH和溫度對蛋白復(fù)性的結(jié)果 影響 很大,但鹽濃度、氧化交換系統(tǒng)的濃度和透析外液體積對蛋白復(fù)性影響不是很大. 【關(guān)鍵詞】 重組人骨形成蛋白2成熟肽;蛋白質(zhì)/分離和提純;蛋白質(zhì)復(fù)性 0引言 骨形成蛋白(bone morphogenetic protEin, BMP) 是轉(zhuǎn)化生長因子 (transforming growth factorbeta, TGF) 超家族的成員, 是廣泛分布于 動物骨組織的酸性蛋白質(zhì), 在修復(fù)骨質(zhì)缺損和促進骨折愈合等方面發(fā)揮重要作用1,其誘導(dǎo)成骨的活性很強,是骨骼系統(tǒng)形成和正常發(fā)育所必不可少的因子2. 目前 ,重組人骨形成蛋白2成熟肽(recombinant human bone morphogenetic protein2 mature peptide,rhBMP2m) 已經(jīng)被商業(yè)化生產(chǎn)并 應(yīng)用 在多種臨床 研究 中,包括 治療 骨質(zhì)缺損、頜面修復(fù)等. 但由于利用哺乳動物細胞制備rhBMP2m,其表達水平很低,純化過程復(fù)雜,使得產(chǎn)品價格高昂,制約著其推廣應(yīng)用3. 雖然從大腸桿菌制備BMP產(chǎn)量高、成本低,但由于BMP活性形式是由含有3對二硫鍵的成熟肽肽鏈再以二硫鍵連接而成的二聚體4,而且BMP含有兩個伸展的非極性片段5,具有很強的疏水性容易沉淀,使BMP復(fù)性的難度很大,目前所報道的復(fù)性方法6,在線復(fù)性7等用于rhBMP者都還有待改進. 本研究探索和優(yōu)化rhBMP2m的復(fù)性條件,試圖提高復(fù)性的二聚體產(chǎn)量,以解決rhBMP2m疏水難溶、不能過濾除菌等難題. 1材料和方法 材料菌種DH5/pDH2rhBMP2m由本教研室構(gòu)建并保存; BioFlo型15 L全自動發(fā)酵罐(美國NBS公司);SPSepharose FF, QSepharose FF(Pharmacia公司);透析膜(截留分子質(zhì)量10 000)(華美公司);低溫高速離心機(湘西儀器儀表廠);超聲細胞粉碎儀JY983(寧波新芝科儀研究所);SDSPAGE垂直平板電泳系統(tǒng)(BIORED公司);溶菌酶(Invitrogen)去氧膽酸鈉(上海伯奧生物 科技 有限公司);TritonX100(FARCO CHEMICAL);DNAase I, SDS(SIGMA公司);丙烯酰胺、NN亞甲基雙丙烯酰胺、醋酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、尿素、巰基乙醇等均為 分析 純國產(chǎn)試劑, (天津化學(xué)試劑六廠和沈陽化學(xué)試劑廠);BCA蛋白定量試劑為本實驗室配制;Low protein marker,標(biāo)準(zhǔn)蛋白(上海生物化學(xué)研究所). 方法 /pDH2rhBMP2m高密度發(fā)酵采用恒溶氧高密度發(fā)酵方法8. 取-70保存的DH5/pDH2rhBMP2m工程菌株甘油菌種,劃LB瓊脂平板,含100 g/mL氨芐青霉素,32培養(yǎng)20 h. 挑單菌落接入6 mL LB培養(yǎng)基中,30搖床培養(yǎng)16 h. 轉(zhuǎn)入300 mL LB,30搖床培養(yǎng)10 h. 轉(zhuǎn)入15 L發(fā)酵罐,計算機自動控制攪拌、通氣溶氧,30繼續(xù)培養(yǎng)16 h. 發(fā)酵罐內(nèi)42誘導(dǎo)表達4 h,結(jié)束發(fā)酵,6000 r/min 離心收菌. 裂菌、包涵體純化用裂解緩沖液(100 g/L蔗糖,10 mmol/L pH TrisHCl,1 mmol/L EDTA)懸浮發(fā)酵所得到的菌體,置冰浴中,按3 mg/g濕菌加入溶菌酶裂菌,16 000 g離心后收得包涵體. 按每克濕沉淀加入3 mL包涵體洗滌液(5 g/L TritonX100,10 mmol/L pH TrisHCl,1 mmol/L EDTA)懸浮包涵體,超聲處理,1360 W,9 s,間歇6 s,20個循環(huán). 16 000 g離心收集包涵體,反復(fù)4次. 離子交換層析純化rhBMP2m SPSepharose FF陽離子柱層析分離: 洗滌后的包涵體溶解于pH 的SPbuffer(8 mol/L尿素,20 mmol/L pH 磷酸鈉緩沖液, mol/L 巰基乙醇)中,充分溶解后上SPSepharose FF陽離子柱,用適合濃度的NaCl溶液洗脫,收集蛋白峰,透析除去尿素巰基乙醇,離心收集沉淀. QSepharose FF陰離子柱層析純化: 將SPSepharose FF柱層析純化的蛋白質(zhì)沉淀溶解于pH 的Q buffer(8 mol/L尿素,20 mmol/L pH Tris, mol/L 巰基乙醇)中,充分溶解后上QSepharose FF陽離子柱,用適合濃度NaCl溶液洗脫,收集蛋白峰,透析除去尿素和巰基乙醇,離心收集沉淀. 蛋白復(fù)性純化后的rhBMP2m經(jīng)變性液(8 mol/L尿素,20 mmol/L pH 磷酸鈉緩沖液, mol/L 巰基乙醇)溶解,裝入透析袋內(nèi),對不同的透析外液進行透析復(fù)性. 各種復(fù)性液的組成(表1). 復(fù)性后,逐步透析除去尿素和巰基乙醇. 最后收集復(fù)性蛋白液,復(fù)性的蛋白液可通過 m微孔濾膜除菌,或進一步濃縮和冰凍干燥. 蛋白定量用NaOH mol/L將BSA標(biāo)準(zhǔn)品(1 g/mL)稀釋成梯度濃度:1000,800,600,400,200,0 g/mL,同樣將蛋白樣品倍比稀釋至適當(dāng)濃度(01000 g/mL). 樣品、梯度標(biāo)準(zhǔn)品各50 L,分別加入200 L工作液(工作液A和B以501的比例均勻混合),混勻后37水浴30 min,以ELISA reader測A562 nm(或A570 nm)吸光度值. 作圖畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線,并決定未知樣本的濃度. 過濾除菌篩選出合適的復(fù)性條件,然后將復(fù)性后的rhBMP2m經(jīng) m微孔濾膜除菌,對通過微孔濾膜前后的液體進行蛋白定量,并計算其損失率. 2結(jié)果 2m的發(fā)酵及包涵體純化發(fā)酵罐中DH5/pDH2rhBMP2m培養(yǎng)16 h和誘導(dǎo)表達4 h后,測發(fā)酵液A600 nm= 發(fā)酵液中rhBMP2m占細菌總蛋白量的20%. 蛋白定量后測算發(fā)酵液中rhBMP2m為 g/L. 經(jīng)洗滌的包涵體中rhBMP2m純度為70%. 包涵體經(jīng)SPSepharose FF柱層析,目的蛋白出現(xiàn)在 mol/L及 mol/L的氯化鈉溶液洗脫峰內(nèi). 蛋白回收率為60%,rhBMP2m純度為85%. 經(jīng)SPSepharose FF柱層析后的蛋白經(jīng)QSepharose FF柱層析純化,目的蛋白位于 mol/L的氯化鈉洗脫峰內(nèi). 透析除去尿素,離心收集蛋白,蛋白回收率為85%,rhBMP2m的純度達到95%. 經(jīng)陽離子和陰離子柱純化后,目的蛋白的回收率為30%. 2m的透析復(fù)性經(jīng)不同復(fù)性緩沖液透析復(fù)性后進行非還原SDSPAGE,然后進行灰度掃描,得到結(jié)果(表1). 表1不同復(fù)性液的組成及復(fù)性后蛋白各組分的比率(略) 復(fù)性液12透析復(fù)性后的產(chǎn)物為可溶性,復(fù)性產(chǎn)物中二聚體含量占總蛋白量的30%左右. 同時得到非還原的SDSPAGE結(jié)果(圖1) M: marker; 1: 復(fù)性前; 2: 復(fù)性后. 圖1復(fù)性液12的復(fù)性產(chǎn)物非還原SDS-PAGE分析(略) 過濾除菌復(fù)性液12透析復(fù)性的rhBMP2m經(jīng) m微孔濾膜除菌,所得到非還原SDSPAGE結(jié)果(圖2). 灰度掃描提示二聚體的含量基本沒有變化
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