（漁業(yè)資源專業(yè)論文）網(wǎng)箱養(yǎng)殖沉積物中有機(jī)物降解細(xì)菌與硫氧化細(xì)菌的篩選及鑒定.pdf

上海海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位 論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除 文中已經(jīng)明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集 體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫，我 對所寫的內(nèi)容負(fù)責(zé)，并完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 學(xué)位論文作者簽名： 日期：矽哞6 月 丕凌。 i 弓日 ， 上海海洋大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定， 同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子 版，允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)上海海洋大學(xué)可以將本學(xué)位 論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、 縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。 保密 口 ，在年解密后適用本版權(quán)書。 本學(xué)位論文屬于 不保密口 學(xué)位論文作者簽名： 岳裳 日期：勘。歸年易月i 弓日 夕乃1 l 魏 勃日 夕 月名#戤年 j y幣教 ： 導(dǎo)期指日 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 答辯委員會成員名單 姓名工作單位職稱備注 楊宇峰暨南大學(xué)教授主席 林欽南海水產(chǎn)研究所研究員委員 鑾j 純匣j南海水產(chǎn)研究所研究員委員 甘居列南海水產(chǎn)研究所研究員委員 廖秀麗南海水產(chǎn)研究所助理研究員秘書 答辯地點(diǎn)南海水產(chǎn)研究所答辯日期2 0 1 0 - 6 - 1 3 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 網(wǎng)箱養(yǎng)殖沉積物中有機(jī)物降解細(xì)菌 與硫氧化細(xì)菌的篩選及鑒定 摘要 海水魚類網(wǎng)箱養(yǎng)殖是一種開放式、人工營養(yǎng)型、高密度和集約化的科學(xué)養(yǎng)魚 方式，在我國經(jīng)過近3 0 年的發(fā)展，已成為廣大沿海地區(qū)最重要的海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)之 一。然而，海水魚類網(wǎng)箱養(yǎng)殖方式自身又是一個對海域生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響的 污染源，尤其在我國淺海網(wǎng)箱養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的殘餌和魚類排泄物直接沉積 在網(wǎng)箱底部并長期積累，已導(dǎo)致大多數(shù)網(wǎng)箱養(yǎng)殖場生態(tài)環(huán)境出現(xiàn)不同程度的惡 化。其中，有機(jī)污染和硫化物污染是網(wǎng)箱養(yǎng)殖環(huán)境的主要污染特征，本研究從大 亞灣大鵬澳網(wǎng)箱養(yǎng)殖場沉積環(huán)境中篩選出能將殘餌有機(jī)物降解和硫化物轉(zhuǎn)化為 硫酸鹽的高效土著細(xì)菌，為進(jìn)一步探索網(wǎng)箱養(yǎng)殖環(huán)境微生物原位修復(fù)技術(shù)研究， 解決網(wǎng)箱養(yǎng)殖業(yè)面臨的重要環(huán)境制約問題有一定的科學(xué)意義。主要研究結(jié)果如 下： 1 、以網(wǎng)箱養(yǎng)殖餌料( 野雜魚魚糜) 作為選擇壓力，通過2 個月的間歇曝氣 選擇性富集，分離出6 株細(xì)菌，通過測定其對野生雜魚魚糜餌料有機(jī)物的降解能 力，進(jìn)一步篩選出4 株對魚糜餌料有機(jī)物有快速、高效降解能力的細(xì)菌，7 日培 養(yǎng)生化需氧量( b o d t ) 在1 0 4 0 - - 11 4 0m g l 1 之間，5 日培養(yǎng)化學(xué)需氧量( c o d m l l ) 去除率在1 3 5 8 - - 4 6 9 之間，有機(jī)物的可生化降解性( b o d s c o d o ) 在 8 1 5 6 - - 8 9 4 3 之間。4 株細(xì)菌兩兩組合的5 日培養(yǎng)c o d m n 平均去除率為 6 4 9 1 士6 5 1 ，是單株菌平均去除率( 3 0 6 0 - a ：1 3 6 3 ) 的2 倍多；而b o d 5 c o d o 在8 6 1 0 , 、一8 9 1 3 之間，與單株菌間沒有明顯差。通過部分長度1 6 sr d n a 序列 分析，與g e n b a n k 和e m b l 數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性檢索，并結(jié)合細(xì)菌形態(tài)及生理生化 特征，結(jié)果表明，有2 株細(xì)菌分別隸屬于表皮葡萄球菌屬( s t a p h y l o c o c c u ss p ) 和鹽單胞菌屬( h a l o m o n a $ s p ) ，另2 株分別與鹽單胞菌屬( h a l o m o n a ss p ) 和 假單胞菌屬( p s e u d o m o n a ss p ) 相近。 2 、以濃度為2m g l 。1 的n a 2 s 5 h 2 0 作為選擇壓力，通過2 個月的間歇曝氣選擇 性富集，分離篩選出1 0 株能將硫化物高效轉(zhuǎn)化為硫酸鹽的細(xì)菌。篩選出來的細(xì)菌 在濃度為5 m g l 以的硫代硫酸鈉( n a z s 2 0 3 5 h 2 0 ) 液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)8 日，p h 值由最初的6 8 下降到5 0 以下后趨于穩(wěn)定；硫化物質(zhì)量濃度從最初的1 2 8 0 m g l 以 降到3 7 4 4 2 4m g l 以之間，硫化物去除率在6 6 9 7 0 8 之間；硫酸根離子的質(zhì) 量濃度從最初的2 3 2 7 m g l 。1 增加到5 9 0 3 “2 4 3 m g l ，硫酸根轉(zhuǎn)化率在6 0 以上。 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 通過部分長度1 6 sr d n a 序列分析，與g e n b a n k 和e m b l 數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性檢索， 并結(jié)合細(xì)菌形態(tài)及生理生化特征，結(jié)果表明，有8 株細(xì)菌屬于鹽硫桿狀菌屬 ( h a l o t h i o b a c i l l u ss p ) ，另外2 株則屬于食烷菌屬( a l c a n i v o r a xs p ) 。 關(guān)鍵詞：海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖，有機(jī)物降解細(xì)菌，硫氧化細(xì)菌，細(xì)菌篩選，細(xì)菌鑒定 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 s c r e e n i n ga n di d e n t i f i c a t i o no fb a c t e r i af o ro r g a n i cp o l l u t a n t d e g r a d a t i o na n ds u l f u r o x i d a t i o ni ns e d i m e n ti nm a r i n ec a g e f i s hf a r m i n ga r e a a bs t r a c t m a r i n ec a g ef i s hf a r m i n gf i r s tb e g a ni ng u a n g d o n gc o a s t a lw a t e r so fc h i n aa t t h ee n do f19 7 0 s ，a n di th a sg r o w nd r a m a t i c a l l yd u r i n gt h el a s tt h r e ed e c a d e s ，a n d b e c o m eo n eo ft h ei m p o r t a n tm a r i n ea q u a c u l t u r ei n d u s t r i e si nc h i n a h o w e v e r , m a r i n ec a g ef i s hf a r m i n gg e n e r a t e sh i g hp o l l u t i o nl o a d i n g s ，e s p e c i a l l yi nt h es e a b o t t o m ，w h e r eh i g hs e d i m e n to x y g e nd e m a n d ，a n o x i cs e d i m e n t s ，p r o d u c t i o no ft o x i c g a s e sa n dad e c r e a s ei nb e n t h i cd i v e r s i t ym a yr e s u l t i nt h i ss t u d y , l o c a lb a c t e r i a s t r a i n sf o ro r g a n i cp o l l u t a n td e g r a d a t i o na n ds u l f u r o x i d a t i o nw e r es c r e e n e df r o mt h e s e d i m e n ti nt h em a r i n ec a g ef i s hf a r mi nd a p e n ga oc o v ei nt h ee a s tc o a s to f s h e n z h e n c i t y , i t h a v es o m es c i e n t i f i c s i g n i f i c a n c e t of u r t h e r e x p l o r e t h e b i o r e m e d i a t i o nf o rp o l l u t e ds e d i m e n te n v i r o n m e n ti nm a r i n ec a g ef a r m ，s o l v et h e e n v i r o n m e n t a lc o n s t r a i n t sf o rm a l i n ec a g ef i s hf a r m i n gi n d u s t r y t h er e s u l t sa r ea s f o l l o w i n g ： 1 s i xb a c t e r i as 位a i n sf o ro r g a n i cp o l l u t a n td e g r a d a t i o nw e r ei s o l a t e da f t e r2 m o n t h so fs e l e c t i v ee n r i c h m e n ti n c u b a t i o n 、析t hf i s hm e a tf e e du n d e ri n t e r m i t t e n t a e r a t i o nc o n d i t i o n t h r o u g ht h ea b i l i t yt e s tf o rd e g r a d a t i o nt ot h el i q u i dw i l dt r a s hf i s h c u l t u r em e d i u m , f o u rb a c t e r i as t r a i n sw e r eo b t a i n e d , w h i c ha l ec a p a b l eo fd e g r a d i n g t h e o r g a n i c t r a s hf i s h p o l l u t a n tr a p i d l ya n de f f i c i e n t l y , t h e7 di n c u b a t i o no f b i o c h e m i c a lo x y g e nd e m a n d ( b o d 7 ) w e r eb e t w e e nl0 4 0m g 。l l14 0m g l ，t h e 5 di n c u b a t i o nf o rt h ea v e r a g ec o d m l r e m o v i n gr a t e ( 1 一c o d f l c o d 0 ) w e r eb e t w e e n l3 5 8 4 6 9 ，a n dt h eb i o c h e m i c a ld e g r a d a t i o nr a t e ( b o d 5 c o d 0 ) w e r eb e t w e e n 81 5 6 8 9 4 3 t h e5 di n c u b a t i o nf o ra v e r a g ec o d m nd e g r a d a t i o n r a t eo f p a i r - s t r a i nm i x e db a c t e r i aw a s6 4 9 1 士6 5 1 ，w h i c hw a s2t i m e sh i g h e rt h a n t h a t 3 0 6 0 - 士13 6 3 o fs i n g l es t r a i n ；a n db o d f l c o d ow e r eb e t w e e n8 6 10 0 o , - - 8 9 13 ， t h e r ew e r en oo b v i o u sd i f f e r e n c e sc o m p a r e d 、析t l lt h o s eo fs i n g l es t r a i n s e q u e n c e a n a l y s i sb a s e do np a r t i a l 16 sr d n aa n dp e r f o r m e db yb l a s t na n df a s t a ， c o m b i n e dw i t l lm o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a lb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f b a c t e r i as h o w e dt h a t2s t r a i n sb e l o n g e dt og e n u so fs t a p h y l o c o c c u ss p a n d l 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 h a l o m o n a ss p ，t h eo t h e r2s t r a i n sm a y b eb e l o n g e dt og e n u so fh a l o m o n a ss p a n d p s e u d o m o n a ss p ，r e s p e c t i v e l y 2 t e nb a c t e r i as t r a i n sf o rs u l f u r o x i d a t i o nw e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e da f t e r2 m o n t h so fs e l e c t i v ee n r i c h m e n ti n c u b a t i o n 、析t h 2 m g l n a e s - 5 h 2 0 u n d e r i m e r m i t t e n ta e r a t i o nc o n d i t i o n t h r o u g ht h ea b i l i t yt e s tf o rs u l f i d er e m o v i n gi nl i q u i d m e d i u mw i m5 m g l n a 2 s 2 0 3 5 h 2 0 t h et e nb a c t e r i as t r a i n sa r ec a p a b l eo fr e m o v i n g s u l f i d er a p i d l ya n de f f i c i e n t l y , a f t e r8 di n c u b a t i o ni nl i q u i dm e d i u m ，t h ep hd e c r e a s e d f r o mt h ei n i t i a l6 8t o5 o ；t h es u l f i d ec o n c e n t r a t i o nd e c r e a s e df r o m1 2 8 0 m g l 1t o 3 7 4 - - 4 2 4m g + l - 1 ，a n df u l f i d er e m o v i n gr a t ei sb e t w e e n6 6 9 a n d7 0 8 ；t h es u l f a t e c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e df r o m2 3 2 7 m g l 1t o5 9 0 3 - 6 2 4 3 m g + l 一s e q u e n c ea n a l y s i s b a s e do np a r t i a l16 sr d n aa n dp e r f o r m e db yb l a s t na n df a s 隊c o m b i n e d 諏t l l m o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a lb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fb a c t e r i as h o w e dt h a t e i g h ts t r a i n so fb a c t e r i aa r eb e l o n g e dt og e n u so fh a l o t h i o b a c i l l u s s p ，a n dt h eo t h e r t w oa r eb e l o n g e dt oa l c a n i v o r a xs p k e yw o r d s ：m a r i n ec a g e f i s hf a r m i n g , o r g a n i cp o l l u t a n td e g r a d i n gb a c t e r i a , s u l f u r o x i d a t i o nb a c t e r i a , s c r e e n i n g ，b a c t e r i a li d e n t i f i c a t i o n w 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 目錄 中文摘要i 英文摘要 第一章引言1 1 1我國海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖面臨的主要環(huán)境問題l 1 2 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖主要污染物及其環(huán)境影響1 1 2 1 有機(jī)物和營養(yǎng)鹽1 1 2 2 藥物污染一2 1 3 水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境微生物修復(fù)研究進(jìn)展2 1 3 1 環(huán)境修復(fù)功能菌的篩選3 1 3 2 海水養(yǎng)殖環(huán)境微生物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用4 1 3 3 固定化微生物修復(fù)技術(shù)研究5 1 3 4 基因工程菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的修復(fù)研究6 1 4 研究目的、意義和技術(shù)路線7 1 4 1 研究目的和意義7 1 4 2 技術(shù)路線7 第二章有機(jī)污染物降解菌的篩選與鑒定9 2 1 材料和方法9 2 1 1 培養(yǎng)基9 2 1 2 菌種選擇性富集、分離與純化9 2 1 3 有機(jī)物降解細(xì)菌的篩選l o 2 1 4 篩選菌株對餌料有機(jī)物的降解能力1 0 2 1 5 篩選菌株對餌料有機(jī)物的聯(lián)合降解能力。l o 2 1 6 有機(jī)物降解細(xì)菌的鑒定l o 2 2 結(jié)果一n 2 2 1 菌種分離和純化1 1 2 2 2 有機(jī)物降解細(xì)菌的篩選1 1 2 2 3 篩選菌株對餌料有機(jī)物的降解能力。1 1 2 2 4 菌株組合對餌料培養(yǎng)基的降解能力1 3 2 2 5 菌株的鑒定1 5 2 2 6 系統(tǒng)發(fā)育分析2 1 2 3 討論和小結(jié)。2 2 2 3 1 討論2 2 2 3 2 小結(jié)2 3 第三章硫氧化細(xì)菌的篩選和鑒定2 4 v 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 3 1 材料和方法2 4 3 1 1 試樣來源2 4 3 1 2 培養(yǎng)基2 4 3 1 3 菌種選擇性富集、分離與純化2 5 3 1 4 硫氧化細(xì)菌的篩選及其對硫化物降解性能試驗2 5 3 1 5 菌種鑒定2 5 3 1 6 系統(tǒng)發(fā)育分析2 5 3 1 7 分析方法2 5 3 2 結(jié)果與分析2 6 3 2 1 菌種分離和純化。2 6 3 2 2 硫氧化細(xì)菌的篩選及其對硫化物去除能力2 6 3 2 3 細(xì)菌鑒定2 8 3 2 4 系統(tǒng)發(fā)育分析3 4 3 3 討論和小結(jié)3 4 3 3 1 討論3 4 3 3 2 小結(jié)3 5 第四章結(jié)論與研究展望3 6 4 1 本論文研究的主要結(jié)論3 6 4 2 本論文研究的創(chuàng)新之處3 7 4 3 研究展望3 7 參考文獻(xiàn)。3 8 i 咐錄3 8 學(xué)術(shù)會議4 5 參與的項目課題、社會活動4 5 已發(fā)表論文4 5 待發(fā)表論文4 5 翌i 謝4 6 v i 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章引言 1 1 我國海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖面臨的主要環(huán)境問題 藍(lán)色農(nóng)業(yè)海水養(yǎng)殖業(yè)是我國大農(nóng)業(yè)中發(fā)展最快、活力較強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益最 高的產(chǎn)業(yè)之一。據(jù)統(tǒng)計，我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)量已由1 9 8 0 年的不足4 5 萬噸發(fā)展到 2 0 0 8 年的1 3 0 7 多萬噸，已成為促進(jìn)農(nóng)( 漁) 業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，發(fā)展和繁榮農(nóng)( 漁) 村經(jīng)濟(jì)，富裕農(nóng)( 漁) 民的重要產(chǎn)業(yè)【l 】。并且，隨著我國海水養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步調(diào) 整、優(yōu)化和發(fā)展，海水養(yǎng)殖業(yè)在我國農(nóng)( 漁) 業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展過程中將具有更重要的 地位，將發(fā)揮更重要的作用。 然而，海水養(yǎng)殖除受外界環(huán)境污染因素影響外( 工業(yè)廢水、生活污水、種植 農(nóng)業(yè)非點(diǎn)源污染，以及海岸( 洋) 工程等) ，海水養(yǎng)殖自身又是一個對養(yǎng)殖生態(tài) 環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響的污染源，易造成養(yǎng)殖“自身污染”，成為影響海水養(yǎng)殖可持續(xù) 發(fā)展的重要制約因素。據(jù)中國漁業(yè)生態(tài)環(huán)境質(zhì)量公報( 農(nóng)業(yè)部，國家環(huán)?？?局，2 0 0 8 ) 1 1 ，2 0 0 7 年，我國海水重點(diǎn)養(yǎng)殖監(jiān)測區(qū)有2 6 6 的面積達(dá)不到漁業(yè) 水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的要求，其中無機(jī)氮、活性磷酸鹽、化學(xué)需氧量和石油類等是主要超 標(biāo)因子，此外，據(jù)統(tǒng)計由于環(huán)境污染造成的漁業(yè)經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)4 2 7 億元。 1 2 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖主要污染物及其環(huán)境影響 海水網(wǎng)箱養(yǎng)魚是一種開放式、人工營養(yǎng)型、高密度和集約化的魚類生產(chǎn)系統(tǒng)。 這就意味著，養(yǎng)殖魚類的生長完全依賴于人工投喂飼料，而養(yǎng)殖魚類對飼料的利 用有限，殘餌、魚類排泄物和代謝廢物必將大量產(chǎn)生，并直接排放到海洋環(huán)境中。 此外，養(yǎng)殖中使用的許多化學(xué)藥品，如用于防治魚病的消毒劑和抗生素，防止污 損生物附著網(wǎng)衣的防污劑，作為營養(yǎng)添加劑的維生素等，以及養(yǎng)殖中的死魚、生 產(chǎn)廢棄物、垃圾和廢水等也會直接排入或散失到海洋環(huán)境中【2 ，3 1 。 1 2 1 有機(jī)物和營養(yǎng)鹽 海水網(wǎng)箱養(yǎng)魚產(chǎn)生的主要環(huán)境污染物質(zhì)是有機(jī)物和營養(yǎng)鹽( n 和p ) 【2 ，3 】。有 關(guān)研究資料顯示，海水網(wǎng)箱養(yǎng)魚投喂的飼料中，只有少部分被魚同化吸收并用于 魚體生長，大部分將進(jìn)入環(huán)境中，約有8 0 - - 8 4 的c 、6 4 - 8 9 的n 和4 8 9 2 的 p 最終將進(jìn)入環(huán)境中。p a e z o s u n a 4 1 等研究了養(yǎng)殖海域底泥中的物質(zhì)平衡，發(fā)現(xiàn) 進(jìn)入水體的總氮、總磷和顆粒物分別有2 4 、8 4 和9 3 沉積在底泥里，而富集 在底泥里的這些污染物，在一定條件下又會重新釋放到水體，成為水體污染最重 要的內(nèi)源。也就是說，有機(jī)質(zhì)在底泥內(nèi)的沉積會使得底泥成為營養(yǎng)物質(zhì)庫，即沉 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 積物中營養(yǎng)鹽向上覆水中釋放，在動力作用下營養(yǎng)鹽再懸浮，從而造成內(nèi)源污染 或稱之為“二次污染”。 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)多為海灣、河口等淺海水域，水體交換條件有限，網(wǎng)箱養(yǎng)魚 產(chǎn)生的有機(jī)物、營養(yǎng)鹽、維生素和微量元素等更易積累并促進(jìn)藻類生長，引發(fā)局 部海域的富營養(yǎng)化問題【5 羽，甚至引發(fā)赤潮災(zāi)害，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。 海水養(yǎng)殖廢物( 有機(jī)質(zhì)) 沉積到海底，被耗氧微生物利用分解，造成沉積物環(huán)境缺 氧，氧化還原電位( e h ) 降低，在厭氧環(huán)境下，硫酸鹽還原菌和反硝化細(xì)菌等厭 氧菌將有機(jī)污染物分解轉(zhuǎn)化為硫化氫和氨，使得局部水域底質(zhì)和水體中硫化物和 氨鹽含量水平升高，進(jìn)而對水生生物和養(yǎng)殖生物帶來毒害。 1 2 2 藥物污染 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖中，為了控制魚病的發(fā)生、治療魚病、消毒、清除敵害生物和 抑制網(wǎng)衣上的污損生物等，經(jīng)常需要用到許多化學(xué)藥品。如在配合飼料中添加防 腐劑以延長飼料存放時間，加入維生素b 1 2 、人工色素、微量元素等飼料添加劑 及抗生素( 金霉素、土霉素和呋喃西林等) 成分以滿足養(yǎng)殖魚類的營養(yǎng)需求，并 提高魚的抗病能力；對患病魚類直接用藥物( 孔雀綠、福爾馬林、硫酸銅和敵百 蟲等) 進(jìn)行消毒處理和治療：用于防止污損生物附著網(wǎng)衣，含有t b t 、銅、鋅 的防污劑等【2 4 】。這些化學(xué)藥品將直接或間接( 主要通過殘餌和魚糞) 進(jìn)入海洋 環(huán)境，對海洋生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定的影響。 養(yǎng)殖過程中藥物的施放在殺滅病蟲害的同時，也使水中的浮游生物和有益 菌、藻類受到抑制、殺傷甚至死亡。例如，水中的微生物、單細(xì)胞藻類等具有抑 制細(xì)菌繁殖的作用，有益微生物群落有助于提高對蝦抗病能力。同時，多種藥物 大劑量重復(fù)使用，會使細(xì)菌發(fā)生基因突變或轉(zhuǎn)移，容易產(chǎn)生抗藥性；一些低濃度 或性質(zhì)穩(wěn)定藥物的殘留，還可能在一些水生生物體內(nèi)產(chǎn)生累積并通過食物鏈放 大，由此對整個水體生態(tài)系統(tǒng)中的生物乃至水產(chǎn)品質(zhì)量安全造成不利影響。 1 3 水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境微生物修復(fù)研究進(jìn)展 環(huán)境修復(fù)技術(shù)有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)法及生物修復(fù)。物理修復(fù)方法主要包括 換水法、沉淀通氣法、過濾法、清淤法、吸附法、磁分離方法。國內(nèi)的很多學(xué)者 利用沸石的吸附作用去除養(yǎng)殖水體中的n h 4 + 收到了良好效果【_ 卜引。但物理法對于 污染物僅是稀釋、聚集或不同環(huán)境中的遷移作用，而且運(yùn)行費(fèi)用較高。 化學(xué)修復(fù)方法包括絮凝法、中和法、絡(luò)合法、氧化還原法等。使用的化學(xué)試 劑容易造成二次污染，例如珠江三角洲沿岸曾經(jīng)大量使用硫酸銅來治理蝦病，造 成該地區(qū)水環(huán)境中嚴(yán)重的銅離子污染【9 j 。而且化學(xué)過程持續(xù)的時間往往較短，生 態(tài)平衡維持時間較短，難以達(dá)到修復(fù)的目的，一般僅作應(yīng)急處理。 2 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 生物修復(fù)方法是利用微生物、植物及其他生物，將環(huán)境中的危險性污染物降 解為二氧化碳和水或轉(zhuǎn)化為其他無害物質(zhì)的工程技術(shù)系統(tǒng)，可分為原位修復(fù)和異 位修復(fù)【1 0 l 。相對于其他修復(fù)技術(shù)來說，生物修復(fù)具有費(fèi)用低廉，處理操作簡單 以及安全性較高等優(yōu)點(diǎn)，是一項發(fā)展?jié)摿^大、環(huán)境友好的處理技術(shù)o l - 1 4 j 。生物 修復(fù)技術(shù)應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境修復(fù)中，對恢復(fù)和優(yōu)化水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境，推動我國水 產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。 植物對污染物的修復(fù)研究最多的是關(guān)于植物對各種有機(jī)物污染、重金屬污染 的處理，均取得不錯的效果。把植物修復(fù)應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的修復(fù)中主要是利 用高等水生植物或者藻類的根系、莖葉等功能單位吸收提取養(yǎng)殖廢水中的氮、磷 等主要污染物以達(dá)到凈化底質(zhì)水質(zhì)的目的。目前應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境修復(fù)的植物 主要為藻類，大型海藻江蘺、孔石莼及其紅藻、微藻、硅藻、螺旋藻、鞭毛藻等 均能顯著降低養(yǎng)殖水體中的氮磷營養(yǎng)鹽【1 孓培】。 動物修復(fù)技術(shù)是利用搭養(yǎng)的腐食性和濾食性魚類、貝類、多毛類、棘皮類、 蚤類等消除或減輕水體中浮游植物和有機(jī)顆粒的污染【1 9 - 2 7 。 相對于植物修復(fù)過程較慢，營養(yǎng)物質(zhì)集中在植物體內(nèi)并沒有真正去除；濾食 性生物等的假糞、生物沉降作用，生物密度過大會加快底質(zhì)的有機(jī)污染來說；微 生物修復(fù)的徹底性和安全性使得微生物修復(fù)更適合用在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的修復(fù)中。 微生物修復(fù)在生物修復(fù)中應(yīng)用較早，早期生物修復(fù)( b i o r e m e d i a t i o n ) 就是專指 微生物修復(fù)。微生物修復(fù)的原理是以有機(jī)物作為微生物生長繁殖所需的碳源和能 源，微生物各種酶的作用下，有機(jī)物經(jīng)過厭氧或好氧分解，發(fā)生一系列的化學(xué)反 應(yīng)，最后降解轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)的過程 2 8 - 2 9 1 。早在1 0 0 多年前就有利用好氧微生物 處理污水與廢水的記載，但真正使用生物修復(fù)工程技術(shù)處理環(huán)境污染物至今不到 3 0 年的歷史。微生物修復(fù)早期主要應(yīng)用于石油泄漏造成的環(huán)境污染，p r i c h a r d 等 利用微生物進(jìn)行a l a s k a 石油泄漏后的環(huán)境修復(fù)，取得很好的效果【3 。 由于微生物修復(fù)的徹底性、安全性等優(yōu)點(diǎn)，微生物修復(fù)逐漸應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖 的污染處理中。在養(yǎng)殖底質(zhì)處理中主要是加快有機(jī)物的礦化，在水體中主要利用 微生物的脫氮作用去除養(yǎng)殖污水的氮和分解有機(jī)污染物。 微生物修復(fù)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要應(yīng)用于養(yǎng)殖環(huán)境的原位修復(fù)中，主要處理 底泥的有機(jī)污染和水體的富營養(yǎng)化問題。 1 3 1 環(huán)境修復(fù)功能菌的篩選 近年來國內(nèi)外科學(xué)家篩選出了不少海水養(yǎng)殖環(huán)境有機(jī)碳、氮、硫和磷等降解 細(xì)菌。在海水池塘養(yǎng)殖環(huán)境微生物修復(fù)研究方面，李秋芬、袁有憲掣3 2 】從蝦池 底質(zhì)中分離、篩選出近1 0 株蝦池有機(jī)物降解菌，初步實驗表明，在短時間內(nèi)， 3 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 可降解蝦池底部有機(jī)物8 0 以上，顯示出良好的應(yīng)用前景。p i n a r t 3 3 】等分離出一 株細(xì)菌k l e b s i e l l ao x yt o e a ，該細(xì)菌能夠耐受濃度高達(dá)1 m 的硝酸鹽，并能有效去 除硝酸鹽。謝航等 3 4 j 篩選出了一些水產(chǎn)養(yǎng)殖功能菌，如地衣芽孢桿菌高效能降 解殘余飼料；假絲酵母菌、莢膜紅假單胞菌分別能高效降解養(yǎng)殖水體氨氮，亞硝 基氮。俞勇等【3 5 】在實驗室條件下，以b o d s c o d 的比值 4 5 作為可生化性好的 指標(biāo)，用來衡量細(xì)菌降解餌料有機(jī)質(zhì)的能力，對1 0 6 株蝦池養(yǎng)殖環(huán)境有機(jī)污染物 降解細(xì)菌進(jìn)行篩選，共獲3 0 株比值在4 5 以上的菌株，最終得到的分別屬于弧 菌屬和芽孢桿菌屬的7 株細(xì)菌均能較好地降解對蝦餌料。以b o d 值表示細(xì)菌利 用對蝦餌料的能力時，在5 d 的時間里7 株菌都能利用7 0 以上餌料，當(dāng)考察c o d 的去除率時發(fā)現(xiàn)7 株菌的c o d 去除率在5 9 6 7 9 2 。 國內(nèi)很多學(xué)者正在積極進(jìn)行大水面網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)好氧反硝化菌、有機(jī)碳降解細(xì) 菌、硫氧化細(xì)菌、磷酸鹽降解細(xì)菌等功能菌的篩選及實踐應(yīng)用效果分析。日本科 學(xué)家發(fā)現(xiàn)枯草菌能分解蛋白質(zhì)和碳水化合物，并且抑制海底硫化物的產(chǎn)生，用該 細(xì)菌處理海洋底泥有機(jī)物，兩個月可減少有機(jī)淤泥2 0 c m 3 6 】。王亞南【3 7 1 從福建海 域近海養(yǎng)殖場底泥篩選出了一些有機(jī)碳化合物降解菌及磷降解細(xì)菌。 1 3 2 海水養(yǎng)殖環(huán)境微生物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用 目前，有益微生物( e m ，e f f e c t i v em i c r o o r g a n i s m s ) 在海水養(yǎng)殖環(huán)境調(diào)控與 修復(fù)，尤其是池塘養(yǎng)殖環(huán)境中得到了廣泛應(yīng)用。由日本琉球大學(xué)比嘉照夫1 3 8 】多 年潛心研究開發(fā)出的一種新型復(fù)合微生物活性菌劑( 由光合菌類、醋酸桿菌類、 放線菌類、乳酸菌類、酵母菌類等五大菌群1 0 個屬1 2 5 種微生物組成) ，被用做 水產(chǎn)養(yǎng)殖的水質(zhì)凈化劑。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水研究所李卓佳等【3 9 - 4 0 l 利用微 生物制劑在魚蝦養(yǎng)殖中應(yīng)用試驗表明：氨氮、亞硝酸鹽氮、硫化氫含量比對照組 降低5 以上，有效地改善了底質(zhì)，并能增加水體中的溶氧，有效的抑制致病菌 如弧菌的滋生。改善了養(yǎng)殖水體的菌群結(jié)構(gòu)，魚蝦的成活率和產(chǎn)量均能得到有效 的提高。蔡惠鳳等】通過微生物制劑和實施水底界面曝氣，有效促進(jìn)底泥中好 氧微生物的生長，加速底泥及其上覆水體中有機(jī)質(zhì)的分解，各實驗組底泥的黑臭 現(xiàn)象明顯得到改善。吳偉【4 2 l 使用假單胞菌和芽孢桿菌屬為主的復(fù)合微生物制劑 處理養(yǎng)殖水體，硝氮、磷酸鹽、硫離子的最大去處率達(dá)到1 0 0 ；氨氮、c o d c r 降幅達(dá)9 5 ，懸浮物去處率達(dá)7 4 ，溶氧上升1 6 ，處理效果驚人。林新華【4 3 】 等的研究表明經(jīng)優(yōu)勢復(fù)合e m 處理后使養(yǎng)殖水體能達(dá)到無污染排放。王彥波l 采用高活性生物修復(fù)菌制劑，對養(yǎng)殖中后期的南美白對蝦池塘進(jìn)行了改善水體質(zhì) 量的試驗，結(jié)果表明：t g 體c o d 和磷酸鹽的含量分別降低3 1 6 4 - 一4 9 7 1 和 3 0 5 8 懶4 3 ，養(yǎng)殖水體的富營養(yǎng)化狀態(tài)明顯改善。 4 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 胡德蓉等【4 5 】調(diào)查了網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)的異氧細(xì)菌和硫酸鹽還原菌的分布和數(shù)量變 化情況，并用光合細(xì)菌與硫酸鹽還原菌進(jìn)行拮抗試驗，初步探討了用有益微生物 修復(fù)海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖環(huán)境。 1 3 3 固定化微生物修復(fù)技術(shù)研究 在應(yīng)用與處理技術(shù)上，固定化細(xì)菌處理工藝等高效處理系統(tǒng)也在研究應(yīng)用 中，該技術(shù)是以化學(xué)或物理的手段將游離微生物定位或限制在一個特定的空間， 使其保持活性，可以被反復(fù)利用，經(jīng)過處理后微生物密度高、活性強(qiáng)、反應(yīng)速度 快，流失少，吳偉【4 6 】報道菌株固定后對養(yǎng)殖水體的氨氮和亞硝氮轉(zhuǎn)化去處率明 顯優(yōu)于游離細(xì)菌。鄭耀通 4 r j 應(yīng)用固定化光合細(xì)菌凈化養(yǎng)魚水質(zhì)試驗，發(fā)現(xiàn)固定 化光合細(xì)菌可顯著提高氨氮和c o d 的去除率，并能增加溶解氧。經(jīng)1 個月的魚 種飼養(yǎng)試驗，固定化光合細(xì)菌組魚體重顯著大于對照組，成活率也高于對照組。 為了降解蝦池底部的有機(jī)物污染，以沸石為載體，沸石固定化菌對餌料浸出液的 降解效果明顯高于非固定化菌【4 射。 s u d e e pp e r u m b a k k a m 4 9 】運(yùn)用混合或純培養(yǎng)群體生物膜中的自然基因轉(zhuǎn)換來 進(jìn)行生物修復(fù)，并用共焦顯微鏡和p c r 檢測有利的顯基因突變。j z a m o r a - c a s t r o 【5 0 】以低密度聚酯為載體構(gòu)件的生物膜來對沿海海洋環(huán)境的污水進(jìn)行生物處理， 此生物膜主要由c y a n o b a c t e r i ag e n e r a ，p r o t e o b a c t e r i a ，及真核生物n i t z s c h i a 組成。 底泥中的各種氮，磷組分保證了生物膜各組分的連續(xù)生長。此生物膜在4 8h 內(nèi) 移除了9 4 的磷酸鹽，7 9 的銨態(tài)氮，7 8 的亞硝酸鹽，8 3 的硝酸鹽，是一種 經(jīng)濟(jì)，環(huán)保的創(chuàng)新污染處理方法。a b b a sr e z a e e 5 1j 以醋菌屬a c e t o b a c t e rx y l i n u m 的細(xì)菌纖維素( m o 為載體固定假單胞菌p s e u d o m o n a s s t u t z e r i ，此技術(shù)在最佳缺氧 環(huán)境條件下表現(xiàn)了高達(dá)1 6k g n 0 3 - nm - 3 d a y 1 的硝酸鹽去除濃度。目前為止，還 無人將細(xì)菌固定在m c 上，m c 的多孔性和純粹性，它對細(xì)菌固定的簡易性和 去除氮的高效性，使得其可作為一種新的細(xì)胞固定載體。周艷紅，黃鳳蓮等 5 2 】 應(yīng)用阿科蔓( a q u a m a t s ) 生態(tài)基+ 復(fù)合微生物群落的處理方法來原位修復(fù)灘涂海水 種植養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中的磷，發(fā)現(xiàn)此技術(shù)不僅能有效地降低種植養(yǎng)殖系統(tǒng)水中的 t p 和d p 濃度，又能維持較穩(wěn)定的處理效果；而且對底泥中的磷也有一定的修復(fù) 作用。李非里等【5 3 1 用甲殼素作為微生物載體處理廢水，取得了良好了效果。 h i s a s h i 等【5 4 】用固定化光合菌處理合成廢水表現(xiàn)出較高的去除效果：4 8 小時 可有效的去除c o d ( 8 9 ) ，磷( 7 7 ) ，硝態(tài)氮( 9 9 ) ，h 2 s ( 9 9 8 ) 。h i s a s h i 等比 較了p v a 和海藻酸鹽兩種材料固定化光合細(xì)菌對魚池水質(zhì)凈化與反硝化的效果。 結(jié)果表明固定化p v a 球比海藻酸鹽固定化球的水質(zhì)凈化能力強(qiáng)。辛福言等1 5 5 j 從 蝦池底泥中分離、篩選了數(shù)株蝦池環(huán)境生物修復(fù)作用菌，并對這些生物修復(fù)作用 5 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 菌包埋在海藻酸鈉中進(jìn)行固定化模擬應(yīng)用；這些菌能以對蝦餌料為唯一碳源和氮 源生長，對對蝦配合餌料具有較強(qiáng)降解能力，7 2h 內(nèi)c o d m n 去除率在6 0 以上， 并可在蝦池環(huán)境條件下良好生長，對養(yǎng)殖對蝦沒有致病作用，且其中6 株可顯著 提高中國對蝦仔蝦的成活率。該菌具有快速消除蝦池底部有機(jī)質(zhì)污染、修復(fù)對蝦 養(yǎng)殖環(huán)境的潛力。 由于養(yǎng)殖污染成分復(fù)雜加上環(huán)境因素的影響，目前，固定化微生物技術(shù)在養(yǎng) 殖水體中的應(yīng)用主要還處在室內(nèi)試驗階段，把固定化微生物技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)中還 需做進(jìn)一步的研究。固定化微生物技術(shù)在養(yǎng)殖廢水處理中的應(yīng)用前景十分廣闊， 這也是廢水生物處理由生物自然凈化一人工培養(yǎng)微生物絮體( 活性污泥) 一人工 強(qiáng)化高效微生物絮體( 微膠囊) 的必然發(fā)展階段。 1 3 4 基因工程菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的修復(fù)研究 微生物修復(fù)優(yōu)點(diǎn)明顯，微生物修復(fù)已經(jīng)逐漸從應(yīng)用機(jī)理和基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)向?qū)嶋H 應(yīng)用方面并且取得了明顯得效果但仍沒能真正大規(guī)模大范圍地應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖 的環(huán)境修復(fù)工程中。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)的微生物學(xué)與現(xiàn)代生物 技術(shù)有機(jī)結(jié)合，大大提高了降解效力，擴(kuò)大了降解范圍。生物學(xué)家利用基因工程 把不同的降解基因移植到同一菌株中，創(chuàng)造出了具有多種降解功能的超級微生 物。海水養(yǎng)殖環(huán)境中主要污染物為蛋白質(zhì)、脂肪酸和纖維素，降解或分解的中間 物質(zhì)有含氮化合物以及含硫化合物，也有氨氮、亞硝酸等有害無機(jī)物。因此，一 種降解菌不可能完成所有物質(zhì)的降解或轉(zhuǎn)化，所以構(gòu)建具有多種功能的“超級工 程菌”在海水養(yǎng)殖環(huán)境修復(fù)中使用也是非常必要的【5 鉗7 1 ?！俺壒こ叹痹诤Ｋ?的使用，不僅可以更為有效地修復(fù)污染的養(yǎng)殖環(huán)境，也會大大降低使用成本。國 內(nèi)已用光合細(xì)菌與酵母融合子處理味精廢水【5 8 】取得了良好效果由于生物修復(fù)技 術(shù)在海水養(yǎng)殖環(huán)境中的應(yīng)用歷史短暫，國內(nèi)國外超級工程菌的構(gòu)建開展較少。 近年來對綜合了兩種或兩種以上的修復(fù)技術(shù)的高效綜合生物修復(fù)技術(shù)在水 產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境修復(fù)中的研究也越來越多。水生植物( 小型藻類) 與細(xì)菌的綜合修復(fù)、 沉淀一貝類過濾一藻類吸附的綜合處理系統(tǒng)、扇貝海藻海參的生態(tài)養(yǎng)殖模式、 人工濕地生態(tài)系統(tǒng)、由養(yǎng)殖生物和生物過濾器等組成的海水閉合循環(huán)養(yǎng)魚系統(tǒng)等 的研究均能顯著改善養(yǎng)殖環(huán)境的污染狀況。 綜合生物修復(fù)技術(shù)結(jié)合了多種修復(fù)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，能對養(yǎng)殖污水進(jìn)行多方面處 理，處理效率較高，并且養(yǎng)殖者能獲得一定的額外經(jīng)濟(jì)效益，是一種有潛力的養(yǎng) 殖廢水處理技術(shù)。但綜合生物修復(fù)技術(shù)相對復(fù)雜，需要更高的管理技術(shù)與工程技 術(shù)，近年來的研究主要還是停留在實驗水平上。 6 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 4 研究目的、意義和技術(shù)路線 1 4 1 研究目的和意義 我國的海水網(wǎng)箱養(yǎng)魚目前還主要是以傳統(tǒng)的浮筏式網(wǎng)箱為主，其抗風(fēng)浪能力 較差，一般都位于避風(fēng)較好，但海水交換較差的內(nèi)灣或港口內(nèi)的淺海海域，網(wǎng)箱 養(yǎng)殖場的生態(tài)環(huán)境自凈化能力也較差。此外，養(yǎng)殖網(wǎng)箱一般成片布設(shè)，養(yǎng)殖技術(shù) 也相對落后，尤其是魚用飼料仍以鮮雜魚或冰鮮雜魚為主，人工配合飼料所占比 例很少，飼料系數(shù)較高，養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的有機(jī)和無機(jī)廢物量大，不但對海洋生 態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了較大的負(fù)面影響，而且隨著養(yǎng)殖“自身污染”效應(yīng)的長期積累，我國 的大多數(shù)海水魚類網(wǎng)箱養(yǎng)殖場自身的生態(tài)環(huán)境都出現(xiàn)了不同程度的惡化。其主要 特征是：( 1 ) 網(wǎng)箱養(yǎng)殖場水體營養(yǎng)指數(shù)偏高，富營養(yǎng)化現(xiàn)象明顯；( 2 ) 海水溶解 氧偏低，底層水體貧氧現(xiàn)象較嚴(yán)重；( 3 ) 海底污染物累積，沉積物變黑發(fā)臭，硫 化物、有機(jī)物和營養(yǎng)鹽含量水平升高，成為了“二次污染源”和病原菌、病毒生存 和繁殖的溫床。海水魚類網(wǎng)箱養(yǎng)殖場生態(tài)環(huán)境的惡化已使我國大多養(yǎng)殖場養(yǎng)殖病 害