藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則.doc

藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則一、概述刺激性、過敏性、溶血性是指藥物制劑經(jīng)皮膚、粘膜、腔道、血管等非口服途徑給藥，對用藥局部產(chǎn)生的毒性（如刺激性和局部過敏性等）和/或?qū)θ懋a(chǎn)生的毒性（如全身過敏性和溶血性等），為臨床前安全性評價的組成部分。藥物的原形及其代謝物、輔料、有關(guān)物質(zhì)及理化性質(zhì)（如pH值、滲透壓等）均有可能引起刺激性和/或過敏性和/或溶血性的發(fā)生，因此藥物在臨床應(yīng)用前應(yīng)研究其制劑在給藥部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示臨床應(yīng)用時可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、毒性靶器官、安全范圍。本指導(dǎo)原則適用于中藥、天然藥物、化學(xué)藥物。二、基本原則（一）試驗管理根據(jù)藥品注冊管理辦法，藥物刺激性、過敏性和溶血性研究必須執(zhí)行藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（GLP）。（二）隨機、對照、重復(fù)試驗設(shè)計應(yīng)遵循隨機、對照、重復(fù)的原則。（三）整體性、綜合性原則應(yīng)根據(jù)受試物特點，充分考慮和結(jié)合藥學(xué)、藥效學(xué)、其他毒理學(xué)及擬臨床應(yīng)用情況等綜合評價，體現(xiàn)整體性、綜合性的原則。（四）具體問題具體分析應(yīng)在遵循安全性評價普遍規(guī)律的基礎(chǔ)上，具體問題具體分析，結(jié)合受試物的特點，在闡明其研究方法或技術(shù)科學(xué)、合理的前提下進行規(guī)范性試驗，對試驗結(jié)果進行全面分析評價。三、基本內(nèi)容（一）受試物和實驗動物1受試物中藥、天然藥物：受試物應(yīng)能充分代表臨床試驗樣品或上市藥品。應(yīng)采用工藝路線及關(guān)鍵工藝參數(shù)確定后的工藝制備，一般應(yīng)為中試或中試以上規(guī)模的樣品，否則應(yīng)有充分的理由。應(yīng)注明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件及配制方法等，由于中藥的特殊性，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，否則應(yīng)提供數(shù)據(jù)支持配制后受試物的質(zhì)量穩(wěn)定性及均勻性。試驗中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明名稱、標(biāo)準(zhǔn)、批號、規(guī)格及生產(chǎn)單位?；瘜W(xué)藥物：受試物應(yīng)采用工藝相對穩(wěn)定、純度和雜質(zhì)含量能反映臨床試驗擬用樣品和/或上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。受試物應(yīng)注明名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件及配制方法等，并附有研制單位的自檢報告。試驗中所用輔料、溶媒等應(yīng)標(biāo)明批號、規(guī)格和生產(chǎn)單位，并符合試驗要求。在藥品研發(fā)的過程中，若受試物的工藝發(fā)生可能影響其安全性的變化，應(yīng)進行相應(yīng)的安全性研究。化學(xué)藥物試驗過程中應(yīng)進行受試物樣品分析，并提供樣品分析報告。成分基本清楚的中藥、天然藥物也應(yīng)進行受試物樣品分析。2實驗動物動物應(yīng)符合國家有關(guān)規(guī)定的等級要求，并具有實驗動物質(zhì)量合格證。動物種屬的選擇根據(jù)觀察指標(biāo)和模型合理性確定，如刺激性試驗應(yīng)選擇與人類皮膚、粘膜等反應(yīng)比較相近的動物，如兔、小型豬等。（二）刺激性試驗刺激性是指非口服給藥制劑給藥后對給藥部位產(chǎn)生的可逆性炎癥反應(yīng)，若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。刺激性試驗是觀察動物的血管、肌肉、皮膚、粘膜等部位接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出、變性或壞死等局部反應(yīng)。1給藥部位一般應(yīng)選擇與臨床給藥相似的部位，并觀察對可能接觸到受試物的周圍組織的影響。2給藥途徑一般應(yīng)與臨床用藥途徑一致，否則應(yīng)加以說明。3對照組 以溶媒和/或賦形劑作為陰性對照，必要時采用已上市制劑作對照。4給藥濃度、劑量與體積可選擇幾種不同濃度，至少應(yīng)包括臨床擬用最高濃度。如果技術(shù)上難以達到臨床擬用最高濃度，如皮膚刺激性試驗，在給藥面積不變的情況下，可通過改變給藥頻次進行劑量調(diào)整，而不應(yīng)通過增加厚度來達到增加給藥量的目的。設(shè)計給藥濃度、劑量與體積時，應(yīng)根據(jù)臨床用藥情況，并考慮受試動物給藥部位的解剖和生理特點，保證受試物在給藥部位的有效暴露。5給藥頻率與周期應(yīng)根據(jù)臨床用藥情況，一般給藥周期最長不超過4周。建議進行恢復(fù)期觀察，同時評價給藥局部及周圍組織毒性反應(yīng)的可逆性。6觀察指標(biāo)6.1 肉眼觀察 應(yīng)詳細(xì)描述局部反應(yīng)，包括紅斑、水腫、充血程度及范圍，計分表示。同時觀察動物的一般狀態(tài)、行為、體征等。6.2 組織病理學(xué)檢查 應(yīng)詳細(xì)描述給藥部位的病理變化，并半定量分析、判斷。提供相應(yīng)的組織病理學(xué)照片。7試驗方法具體可參考附錄中常用方法和相關(guān)文獻。8統(tǒng)計方法根據(jù)實驗?zāi)Ｐ秃驮囼灧椒ㄟx擇合適的統(tǒng)計方法。（三）過敏性試驗過敏性又稱超敏反應(yīng)，指機體受同一抗原再刺激后產(chǎn)生的一種表現(xiàn)為組織損傷或生理功能紊亂的特異性免疫反應(yīng)。過敏性試驗是觀察動物接觸受試物后的全身或局部過敏反應(yīng)。1試驗方法進行何種過敏性試驗應(yīng)根據(jù)藥物特點、臨床適應(yīng)癥、給藥方式、過敏反應(yīng)發(fā)生機制、影響因素等確定。通常局部給藥發(fā)揮全身作用的藥物（如注射劑和透皮吸收劑等）需考察型過敏反應(yīng)，如注射劑需進行主動全身過敏試驗（Active Systemic Anaphylaxis, ASA）和被動皮膚過敏試驗（Passive Cutaneous Anaphylaxis, PCA），透皮吸收劑需進行主動皮膚過敏試驗（Active Cutaneous Anaphylaxis, ACA）。吸入途徑藥物應(yīng)采用豚鼠吸入誘導(dǎo)和刺激試驗。粘膜給藥應(yīng)結(jié)合受試物的特點參照經(jīng)皮給藥過敏性試驗方法進行。如受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與文獻報道產(chǎn)生其他過敏反應(yīng)的化合物相同或相似者建議考慮采取適當(dāng)?shù)脑囼灧椒ㄒ钥疾炱涫欠衲芤鹌渌^敏反應(yīng)（如光過敏性反應(yīng)等）。和型過敏反應(yīng)可結(jié)合在重復(fù)給藥毒性試驗中觀察，如癥狀、體征、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及相關(guān)的病理組織學(xué)改變等。經(jīng)皮給藥制劑（包括透皮劑）應(yīng)進行IV型過敏反應(yīng)試驗，包括豚鼠最大化試驗（Guinea-Pig Maximization Test, GPMT）或豚鼠封閉斑貼試驗（BuehlerTest）或其他合理的試驗方法如小鼠局部淋巴結(jié)試驗（Murine Local Lymph Node Assay, LLNA）等。2劑量設(shè)計建議選擇多個劑量，至少應(yīng)包括臨床最高給藥濃度。3對照組應(yīng)設(shè)立陽性對照組和陰性對照組，必要時采用已上市制劑作對照。4統(tǒng)計方法根據(jù)實驗?zāi)Ｐ秃驮囼灧椒ㄟx擇合適的統(tǒng)計方法。（四）溶血性試驗溶血性是指藥物制劑引起的溶血和紅細(xì)胞凝聚等反應(yīng)。溶血性反應(yīng)包括免疫性溶血與非免疫性溶血。溶血性試驗是觀察受試物是否能夠引起溶血和紅細(xì)胞凝聚等。1. 適用范圍凡是注射劑和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反應(yīng)的其他局部用藥制劑均應(yīng)進行溶血性試驗。2. 試驗方法溶血試驗包括體外試驗和體內(nèi)試驗，常規(guī)采用體外試管法評價藥物的溶血性，若結(jié)果為陽性，應(yīng)與相同給藥途徑的上市制劑進行比較研究，必要時進行動物體內(nèi)試驗或結(jié)合重復(fù)給藥毒性試驗，應(yīng)注意觀察溶血反應(yīng)的有關(guān)指標(biāo)（如網(wǎng)織紅細(xì)胞、紅細(xì)胞數(shù)、膽紅素、尿蛋白，腎臟、脾臟、肝臟繼發(fā)性改變等），如出現(xiàn)溶血時，應(yīng)進行進一步研究。（五）光毒性（光刺激性）試驗光敏反應(yīng)是用藥后皮膚對光線產(chǎn)生的不良反應(yīng)，包括光毒性反應(yīng)和光過敏反應(yīng)，均由受試物所含的感光物質(zhì)引起，產(chǎn)生光敏反應(yīng)需同時滿足以下條件：吸收自然光線（波長范圍為290700nm），吸收UV/可見光后產(chǎn)生活性物質(zhì)，在光暴露組織（如皮膚，眼睛等）有充分的暴露。光毒性是由光誘導(dǎo)的非免疫性的皮膚對光的反應(yīng)，是指藥物吸收的光能量在皮膚中釋放導(dǎo)致皮膚損傷的作用。光毒性反應(yīng)是光敏反應(yīng)中最常見的一種反應(yīng)，其臨床表現(xiàn)與曬傷相似，表現(xiàn)為紅斑、水腫、皮膚瘙癢和色素沉著，嚴(yán)重者可產(chǎn)生局部壞死、潰爛或表皮脫落。皮膚給藥光毒性試驗的目的是觀察受試物接觸皮膚或應(yīng)用后遇光照射是否有光毒性反應(yīng)。若受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)或某些組成（包括藥物和賦形劑）文獻報道有光毒性作用，或其化學(xué)結(jié)構(gòu)與已知光敏劑相似，或曾有報道其具有或可疑具有光毒性作用，建議進行皮膚給藥光毒性試驗。四、結(jié)果分析與評價（一）詳細(xì)說明實驗方法，受試物、試驗分組、給藥劑量、動物數(shù)、用藥次數(shù)、毒性反應(yīng)、持續(xù)時間、恢復(fù)情況及時間、死亡動物數(shù)等，對不同劑量（或濃度）下某種反應(yīng)發(fā)生情況及嚴(yán)重程度進行表述，分析毒性反應(yīng)的量效關(guān)系和可能的時效關(guān)系及可逆性，判斷藥物相關(guān)性，提供安全范圍等。（二）刺激性試驗應(yīng)重視給藥濃度、體積、速度、次數(shù)與有效暴露時間對結(jié)果的影響。注射劑的給藥濃度、速度及次數(shù)與藥物的血管刺激性密切相關(guān)，建議根據(jù)受試物的性質(zhì)、臨床用藥情況，采用適當(dāng)?shù)姆椒?，盡最大可能地暴露毒性，如可適當(dāng)增加濃度，或通過增加給藥次數(shù)等。過敏試驗應(yīng)注意給藥劑量和給藥速度對過敏反應(yīng)的影響，靜脈注射激發(fā)應(yīng)保證足量、一次性快速地將受試物注射入動物體內(nèi)。經(jīng)皮給藥的受試物應(yīng)保證在局部的有效暴露濃度和時間。（三）重視組織病理學(xué)檢查，并提供相應(yīng)的照片。（四）由于實驗動物模型的局限性，如目前仍無理想的和型過敏反應(yīng)的動物模型；光過敏性動物模型的臨床意義尚不明確等，因此一些藥物的過敏性臨床前評價可采取靈活的方式，建議采用多種方法如BT、小鼠局部淋巴結(jié)試驗等。（五）在溶血性試驗中，若出現(xiàn)紅細(xì)胞凝聚現(xiàn)象，應(yīng)判定是真凝聚還是假凝聚。若體外出現(xiàn)可疑溶血現(xiàn)象，應(yīng)采用其他方法進一步試驗，以確定或排除受試物的溶血作用。利用分光光度法進行溶血性試驗時，應(yīng)注意離心速度及溫度對結(jié)果的影響。此外，因不同的注射劑顏色及深淺不同，若其色澤對血紅素的最大吸收有干擾，則應(yīng)注意排除非藥物因素。（六）結(jié)合藥物的制劑特點、藥理作用其他毒理學(xué)試驗結(jié)果、以及臨床信息等綜合分析和評價。五、參考文獻1FDA Guidance for Industry Skin irritation and sensitization testing of generic transdermal drug products2FDA Guidance for Industry Photosafety testing3FDA Guidance for Industry Immunotoxicology evaluation of investigation new drug4. EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.7800 Immunotoxicity5EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2500 Acute dermal irritation6EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2600 Skin sensitization7OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No 406, July 1992)8EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2400 Acute eye irritation9EMA Non-clinical local tolerance testing of medicinal products10ISO 10993-10:2002(E) Biological evaluation of medical devices- Part 10- Tests for irritation and delayed-type hypersensitivity11日本厚生省日本新藥毒性試驗指導(dǎo)原則 1989版12中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局 新藥（西藥）臨床及臨床前研究指導(dǎo)原則匯編13徐叔云 卞如濂 陳修 藥理實驗方法學(xué)14陳奇 中藥藥理研究方法學(xué)15皮膚用藥的毒性試驗和粘膜用藥的毒性試驗. 中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局 中藥新藥研究指南1994年209，21316袁伯俊 王治喬 皮膚用藥毒性試驗. 新藥臨床前安全性評價與實踐 北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，1997年 15217劉建文 其他毒性試驗. 藥理實驗方法學(xué)第三版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2002年 23418. Principles and methods of Toxicology. Fourth edition, edited by A. Wallace Hayes, Taylor & Francis, Philadelphia. 2001.19. EMA；Note for Guidance on Non-clinical Local Tolerance Testing of Medicinal Products.20FDA；Guidance for Industry Botanical Drug Products21FDA；Guidance for Industry Labeling Guidance for OTC Topical Drug Products for the Treatment of Vaginal Yeast Infections (Vulvovaginal Candidiasis) 22. FDA；Guidance for Industry Bacterial Vaginosis - Developing Antimicrobial Drugs for Treatment23Preclinical Development Hand Book-Toxicology. Edited by Shayne Cox Gad, Copyright 2008 by John Wiley & Sons, Inc六、附錄本附錄收載的試驗方法僅供參考。應(yīng)根據(jù)受試物的特點采用國內(nèi)外公認(rèn)的科學(xué)合理的試驗方法，不僅限于此附錄。（一）刺激性試驗方法1血管刺激性試驗通常選兔，每組不少于3只。設(shè)生理鹽水和/或溶媒對照，可采用同體左右側(cè)自身對比法。給藥部位根據(jù)臨床擬用途徑確定，一般選用耳緣靜脈?？稍O(shè)多個給藥濃度，至少包括臨床最大擬用濃度，給藥容積、速率和期限一般根據(jù)臨床擬用法用量，并根據(jù)動物情況進行調(diào)整，給藥體積不可太低。多次給藥時間一般不超過7天。根據(jù)受試藥物的特點和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時間和剖檢時間，至少觀察72小時。應(yīng)對部分動物進行組織病理學(xué)檢查?；謴?fù)期動物根據(jù)受試物的特點和刺激性反應(yīng)情況，繼續(xù)觀察1421天進行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)肉眼觀察和組織病理學(xué)檢查結(jié)果綜合判斷受試物的血管刺激性及刺激性恢復(fù)情況。2. 肌肉刺激性試驗通常選兔，也可選用大鼠。每組不少于3只。應(yīng)設(shè)生理鹽水對照或/和溶媒對照組，可采用同體左右側(cè)自身對比法。根據(jù)受試物的特點和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時間, 觀察期結(jié)束時應(yīng)對部分動物進行組織病理學(xué)檢查。分別在左右兩側(cè)股四頭肌內(nèi)注射給藥，觀察給藥后不同時間的局部反應(yīng)，如充血、紅腫等。給藥后4872小時剖檢觀察注射局部的刺激反應(yīng)，按表1計算相應(yīng)的反應(yīng)級，并進行局部組織病理學(xué)檢查，提供病理照片。根據(jù)表1計算肌肉刺激性總反應(yīng)級，計算平均值，按表2判定刺激等級。若各股四頭肌反應(yīng)級的最高與最低之差大于2，應(yīng)另取動物重新試驗。表1 肌肉刺激反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)刺激反應(yīng)反應(yīng)級無明顯變化0輕度充血，范圍在0.51.0cm以下1中度充血，范圍在0.51.0cm以上2重度充血，伴有肌肉變性3出現(xiàn)壞死，有褐色變性4出現(xiàn)廣泛性壞死5表2 平均分值和等級平均分值等級0.00.4無0.51.4輕微1.52.4輕度2.53.4中度3.54.4重度4.5及以上嚴(yán)重3皮膚刺激性試驗通常選兔、小型豬，否則應(yīng)闡明合理性。兔每組不低于4只。一般應(yīng)進行相同備皮面積的正常皮膚和破損皮膚局部刺激性試驗。采用同體左右側(cè)自身對比法，將受試物直接涂于備皮處，敷料覆蓋固定。貼敷時間至少4小時。多次給藥皮膚刺激性試驗應(yīng)連續(xù)在同一部位給藥，每次給藥時間相同，給藥期限一般不超過4周。破損皮膚試驗中皮膚破損程度以損傷表皮層為限。在自然光線或全光譜燈光下肉眼觀察皮膚反應(yīng)。根據(jù)受試物的特點和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時間。通常單次給藥皮膚刺激性試驗觀察時間點為去除藥物后3060分鐘，24、48和72小時。多次給藥皮膚刺激性試驗，為每次去除藥物后1小時以及每次給藥前，以及末次貼敷去除藥物后3060分鐘，24、48和72小時。如存在持久性損傷，有必要延長觀察期限以評價恢復(fù)情況和時間，延長期一般不超過2周。對出現(xiàn)中度及中度以上皮膚刺激性的動物應(yīng)在觀察期結(jié)束時進行組織病理學(xué)檢查，并提供病理照片。單次給藥皮膚刺激性試驗，計算各組每一時間點皮膚反應(yīng)積分的平均值，按表3進行刺激強度評價。多次給藥皮膚刺激性試驗，首先計算每一觀察時間點各組積分均值，然后計算觀察期限內(nèi)每天每只動物刺激積分均值，按表4進行刺激強度評價。表3 皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)刺激反應(yīng)分值紅 斑無紅斑0輕度紅斑（勉強可見）1中度紅斑（明顯可見）2重度紅斑3紫紅色紅斑到輕度焦痂形成4水 腫無水腫0輕度水腫（勉強可見）1中度水腫（明顯隆起）2重度水腫（皮膚隆起1mm，輪廓清楚）3嚴(yán)重水腫（皮膚隆起1mm以上并有擴大）4最高總分值8表4 皮膚刺激強度評價標(biāo)準(zhǔn)分 值評 價00.49無刺激性0.52.99輕度刺激性3.05.99中度刺激性6.08.00重度刺激性4. 粘膜刺激性試驗4.1 眼刺激性試驗通常選兔，每組不少于3只。應(yīng)設(shè)生理鹽水對照組，可采用同體左右側(cè)自身對比法。動物眼睛滴入受試物，保證藥物充分暴露。給藥期限應(yīng)根據(jù)臨床擬用方法確定。多次給藥時每天給藥次數(shù)應(yīng)不少于臨床用藥頻率。 應(yīng)根據(jù)受試物的特點和刺激性反應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)挠^察時間。通常單次給藥為給藥后1、2、4、24、48和72小時；多次給藥眼刺激試驗為每天給藥前以及最后一次給藥后1、2、4、24、48和72小時。如存在持久性損傷，有必要延長觀察期限，一般不超過21天。一般采用裂隙燈進行眼刺激反應(yīng)檢查，也可根據(jù)刺激性反應(yīng)情況采用其他的合適器械。在整個觀察過程中應(yīng)進行熒光素鈉染色檢查。每次檢查都應(yīng)記錄眼部異常反應(yīng)，根據(jù)表5計算分值。根據(jù)表6判斷刺激程度。表5 眼刺激反應(yīng)分值標(biāo)準(zhǔn)眼刺激反應(yīng)分值角 膜無混濁0散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見1半透明區(qū)易分辨，虹膜模糊不清2出現(xiàn)灰白色半透明區(qū)，虹膜細(xì)節(jié)不清，瞳孔大小勉強可見3角膜不透明，虹膜無法辨認(rèn)4虹 膜正常0皺褶明顯加深、充血、腫脹，角膜周圍輕度充血，瞳孔對光仍有反應(yīng)1出血/肉眼可見壞死/對光無反應(yīng)（或其中一種）2結(jié) 膜充血（指瞼結(jié)膜和球結(jié)膜）血管正常0血管充血呈鮮紅色1血管充血呈深紅色，血管不易分辨2彌漫性充血呈紫紅色3水 腫無水腫0輕微水腫（含眼瞼）1明顯水腫伴部分眼瞼外翻2水腫至眼瞼近半閉合3水腫至眼瞼超過半閉合4分泌物無分泌物0少量分泌物1分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著2分泌物使整個眼區(qū)潮濕或粘著3最大總積分16表6 眼刺激性評價標(biāo)準(zhǔn)分值評價03無刺激性48輕度刺激性912中度刺激性1316重度刺激性4.2 滴鼻劑和吸入劑刺激性試驗可選用兔、豚鼠或大鼠。給藥后觀察動物全身狀況（如呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)）及局部刺激癥狀（如哮喘、咳嗽、嘔吐、窒息等癥狀）等。單次給藥24小時后或多次給藥停藥后24小時處死動物，觀察呼吸道局部（鼻、喉、氣管、支氣管）粘膜組織有無充血、紅腫等現(xiàn)象，并進行病理組織學(xué)檢查。4.3 陰道刺激性試驗通常選用大鼠、兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動物種屬的最大給藥量。給藥頻率根據(jù)臨床應(yīng)用情況，通常每天12次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少4小時。觀察內(nèi)容：陰道部位、臨床表現(xiàn)（如疼痛癥狀）和陰道分泌物（如血、粘液）等，給藥后動物死亡和剖檢結(jié)果，局部組織有無充血、水腫等現(xiàn)象，并進行陰道和生殖系統(tǒng)病理組織學(xué)檢查等。4.4 直腸刺激性試驗通常選兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動物種屬的最大可行量。給藥頻率根據(jù)臨床擬用情況，通常每天12次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少24小時，必要時可封閉一定時間。觀察內(nèi)容：包括肛門區(qū)域和肛門括約肌，給藥后臨床表現(xiàn)（如疼痛癥狀）和糞便（如血、粘液），給藥后死亡和剖檢結(jié)果，局部組織有無充血、水腫等現(xiàn)象，并進行肛周組織的病理組織學(xué)檢查。4.5 口腔用藥、滴耳劑等刺激性試驗可參照上述試驗，給藥途徑為口腔、外耳道給藥，觀察對口腔和喉粘膜，以及對外耳道和鼓膜等的影響。口腔用藥建議用金黃倉鼠，觀察受試物對頰粘膜的刺激性。5皮膚給藥光毒性試驗成年白色豚鼠，雌雄各半。每組動物數(shù)至少6只。應(yīng)設(shè)陰性、陽性對照組和受試物不同劑量組，至少包括臨床用藥濃度。試驗前動物備皮涂敷藥物。給藥30分鐘后覆蓋固定，UV光源照射（UVA波長為320-400nm，如含UVB，其劑量不得超過0.1J/cm2）。試驗結(jié)束后分別于1、24、48和72h觀察皮膚反應(yīng)，根據(jù)表7計算評分。單純涂受試物而未經(jīng)照射區(qū)域未出現(xiàn)皮膚反應(yīng)，而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域出現(xiàn)皮膚反應(yīng)分值之和2的動物數(shù)1只時，判為受試物具有光毒性。表7 皮膚反應(yīng)的評分標(biāo)準(zhǔn)紅斑和焦痂形成分值水腫形成分值無紅斑0無水腫0非常輕的紅斑，勉強可見1非常輕度水腫，勉強可見1明顯的紅斑2輕度水腫（邊緣清晰）2中度至重度的紅斑3中度水腫（皮膚隆起約1mm）3重度紅斑（鮮紅色）至輕度焦痂形成（深層損傷）4重度水腫（皮膚隆起大于1mm，并超過涂受試物的區(qū)域）4（二）過敏性試驗方法1主動全身過敏試驗（ASA）通常選用體重為300400克的豚鼠。每組動物數(shù)至少6只。設(shè)陰性、陽性對照組和受試物不同劑量組，至少包括臨床擬用最高劑量或濃度。陰性對照組給予同體積的溶媒，陽性對照組給予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質(zhì)。選擇容易產(chǎn)生抗體的給藥途徑，如腹腔、靜脈或皮下注射，隔日一次，共給藥3次，給藥體積0.5 ml，末次注射后第14天、第21天分別快速靜脈注射致敏劑量的2倍進行攻擊。即刻觀察動物反應(yīng)至30分鐘，包括癥狀的出現(xiàn)及消失時間，一般應(yīng)觀察3小時。致敏期間每日觀察動物的癥狀，首末次致敏和激發(fā)當(dāng)日測定動物體重。按表9判斷過敏反應(yīng)發(fā)生程度，計算發(fā)生率。表8 過敏反應(yīng)癥狀0 正常7 呼吸急促14 步態(tài)不穩(wěn)1 不安寧8 排尿15 跳躍2 豎毛9 排糞16 喘息3 發(fā)抖10 流淚17 痙攣4 搔鼻11 呼吸困難18 旋轉(zhuǎn)5 噴嚏12 哮鳴音19 潮式呼吸6 咳嗽13 紫癜20 死亡表9 全身致敏性評價標(biāo)準(zhǔn)0-過敏反應(yīng)陰性14癥狀+過敏反應(yīng)弱陽性510癥狀+過敏反應(yīng)陽性1119癥狀+過敏反應(yīng)強陽性20+過敏反應(yīng)極強陽性2主動皮膚過敏試驗（ACA）通常選豚鼠。受試物應(yīng)與臨床擬用制劑一致，應(yīng)為含活性成分和賦形劑或含透皮促進劑的混合制劑。若受試物為膏劑或液體，則一般不稀釋；若受試物為固體粉末，則需與適量水或賦形劑混勻，以保證受試物與皮膚的良好接觸。當(dāng)使用賦形劑時，應(yīng)考慮其對受試物透皮吸收的影響。應(yīng)設(shè)陽性對照和陰性或賦形劑對照。在致敏接觸階段，應(yīng)充分保證受試物在皮膚的停留時間（6小時）和接觸皮膚的范圍。第0、第7和第14天，同樣方法給藥。末次給藥后14天，再次給藥激發(fā)，給藥6小時左右后，觀察72小時內(nèi)皮膚過敏反應(yīng)情況，并按表10評分，按表11計算發(fā)生率。同時應(yīng)觀察動物是否有哮喘、站立不穩(wěn)或休克等全身過敏反應(yīng)。表10 皮膚過敏反應(yīng)程度的評分標(biāo)準(zhǔn)皮膚過敏反應(yīng)分值紅斑無紅斑0輕度紅斑，勉強可見1中度紅斑，明顯可見2重度紅斑3紫紅色紅斑到輕度焦痂形成4水腫無水腫0輕度水腫，勉強可見1中度水腫，明顯可見（邊緣高出周圍皮膚）2重度水腫，皮膚隆起1mm，輪廓清楚3嚴(yán)重水腫，皮膚隆起1mm以上或有水泡或破潰4最高總分值8表11 皮膚致敏性評價標(biāo)準(zhǔn)致敏發(fā)生率（%）皮膚致敏性評價010無致敏性1130輕度致敏性 3160中度致敏性6180高度致敏性81100極度致敏性3被動皮膚過敏試驗（PCA）通常選大鼠，可用小鼠，有時根據(jù)試驗需要用豚鼠，選擇動物時應(yīng)考慮IgE的出現(xiàn)時間。每組動物數(shù)至少6只。應(yīng)設(shè)立陰性、陽性對照組和受試物不同劑量組，至少包括臨床擬用最大劑量或濃度。陰性對照組應(yīng)給予同體積的溶媒，陽性對照組給予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質(zhì)。選擇容易產(chǎn)生抗體的給藥方法，如靜脈、腹腔或皮下注射等，隔日一次，共給藥35次；末次致敏后第1014天制備致敏血清。激發(fā)時動物備皮處皮內(nèi)注射合適稀釋度的致敏血清0.1mL，24或48小時后，靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量的0.5%1%伊文思蘭染料共1mL。由于不同種屬動物接受含IgE抗體血清后，至能夠應(yīng)答抗原攻擊產(chǎn)生過敏反應(yīng)的時間不同，需注意激發(fā)時間選擇的合理性。激發(fā)注射30分鐘后測量皮膚內(nèi)層的斑點大小，直徑大于5mm者為陽性。不規(guī)則斑點的直徑為長徑與短徑之和的一半，并提供藍(lán)斑照片。4豚鼠Buehler試驗（BT）和最大化試驗（GPMT）通常選成年豚鼠。受試物組不少于20只、對照組不少于10只。應(yīng)設(shè)立陰性對照組和陽性對照組。推薦的陽性對照物有巰基苯并噻唑，苯佐卡因，二硝基氯苯，331環(huán)氧樹脂等，也可以使用其他的陽性對照物，但輕中度的致敏劑在加佐劑的試驗中至少30%和不加佐劑試驗中至少15%應(yīng)有反應(yīng)。取決于所選擇的方法。在Buehler試驗中，致敏劑量應(yīng)當(dāng)足夠高，以產(chǎn)生輕微的刺激性，激發(fā)劑量為不產(chǎn)生刺