CD40分子在B細(xì)胞發(fā)育分化中的作用.doc

CD40分子在B細(xì)胞發(fā)育分化中的作用國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)2000年第23卷第1期蘇州醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究室，江蘇蘇州 215007 周照華摘 要 B淋巴細(xì)胞在胚肝及骨髓中生成并經(jīng)過一定階段的分化發(fā)育，再遷移至外周免疫器官（包括淋巴結(jié)、脾臟及扁桃體）作為成熟的slgD+slgM+B細(xì)胞,亦稱幼稚B細(xì)胞；在抗原特異性免疫反應(yīng)中，B細(xì)胞經(jīng)一系列連鎖事件而成為分泌Ig的漿細(xì)胞或記憶性B細(xì)胞，這些事件包括特異性抗原識(shí)別、激活、擴(kuò)增、體細(xì)胞突變、同種型轉(zhuǎn)換和分化等。這些抗原依賴性事件發(fā)生在次級(jí)淋巴器官及非淋巴器官的不同區(qū)域，同時(shí)，B細(xì)胞必須與抗原以及T細(xì)胞、DCs等其他細(xì)胞發(fā)生接觸及相互作用。這種相互作用是通過一系列不同的細(xì)胞膜表面分子及細(xì)胞因子來實(shí)現(xiàn)。其中最關(guān)鍵的膜分子之一是CD40分子。本文就B淋巴細(xì)胞的發(fā)育與分化過程中CD40分子可能的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展作一綜述。關(guān)鍵詞：CD40分子B淋巴細(xì)胞發(fā)育分化1 CD40分子對(duì)B淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng) 抗CD40單抗因其能與IgM抗體或佛波脂（phorbol csters）共刺激使純化的B細(xì)胞擴(kuò)增而著名1。1991年Banchereau等報(bào)道了“CD40系統(tǒng)”。所謂CD40系統(tǒng)，就是在培養(yǎng)體系中加入轉(zhuǎn)染了人的Fc（CD32）的鼠纖維母細(xì)胞以及CD40活化型單抗。由于FcR與CD40單抗的Fc部分共價(jià)結(jié)合，從而使CD40單抗發(fā)生交聯(lián)，繼而培養(yǎng)體系中B細(xì)胞膜表面CD40分子交聯(lián)，從而使擴(kuò)增效應(yīng)大為提高。CD40系統(tǒng)能導(dǎo)致B細(xì)胞（input b cells）擴(kuò)增35倍，如果常規(guī)培養(yǎng)基足夠豐富，這種培養(yǎng)系統(tǒng)可保持3周。該系統(tǒng)能使各種B細(xì)胞亞群（包括sIgD+,sIgM+幼稚B細(xì)胞，生發(fā)中心CD38+sIgD+B細(xì)胞，CD38-sIgD-記憶B細(xì)胞以及CD5-及CD5-B細(xì)胞）擴(kuò)增。用抗Ig抗體或SAC（金黃色葡萄球菌）共激發(fā)抗原受體導(dǎo)致更高的增殖效應(yīng)。在CD40系統(tǒng)中培養(yǎng)的B細(xì)胞，如果加入IL-4或IL-13將導(dǎo)致其長(zhǎng)期增殖和正常B細(xì)胞系或B細(xì)胞克隆呈因子依賴性長(zhǎng)期生長(zhǎng)。CD40系統(tǒng)與IL-4共培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CD19、CD20、CD40、sIg，高表達(dá)CD23以及HLA class 抗原2。IL-10能提高CD40激活的B細(xì)胞增殖，并且在早期培養(yǎng)中幾乎與IL-4樣有效。IL-4與IL-10聯(lián)用導(dǎo)致額外的細(xì)胞增殖，單用IL-2很少會(huì)增加抗CD40激發(fā)B細(xì)胞的增殖作用。因IL-10上調(diào)抗CD40激發(fā)的B細(xì)胞上CD25/Tac的表達(dá)時(shí)加入IL-2會(huì)強(qiáng)烈提高B細(xì)胞的增殖效應(yīng)3。在IL-10作用下，B細(xì)胞可形成凝集（aggregation），并能形成漿母細(xì)胞(Plasmabaasts)。用CD40L來替代CD40單抗研究發(fā)現(xiàn)，IL-13+CD40L引起扁桃體及脾臟B細(xì)胞增殖，但不能引起外周血B細(xì)胞增殖（可能由于外周血B細(xì)胞增殖通常需要更強(qiáng)的刺激）；但I(xiàn)L-13+CD40L能阻止外周B細(xì)胞凋亡，這是因?yàn)镮L-13+CD40L，引起外周血B細(xì)胞高表達(dá)BCL-2家族基因成員BCL-XL及MAL-1，BCL-XL在保持靜止及激發(fā)后的B細(xì)胞存活中起關(guān)鍵作用，而MAL-1在調(diào)節(jié)靜止B細(xì)胞存活中起作用。但BCL-XL及MAL-1是否對(duì)IL-13+CD40L抑制的外周B細(xì)胞凋亡是必須的，還須經(jīng)基因敲除技術(shù)才能直接證實(shí)4。2 CD40分子對(duì)外周及生發(fā)中心B細(xì)胞的分化效應(yīng) CD40分子的激發(fā)與不同細(xì)胞因子協(xié)同可對(duì)B細(xì)胞的分化產(chǎn)生不同的效應(yīng)。在CD40系統(tǒng)中與SAC顆粒共培養(yǎng)的人B細(xì)胞不但增殖強(qiáng)烈，而且令人驚異地產(chǎn)生大量的IgM、IgG和IgA，但無IgE產(chǎn)生5.。因?yàn)橛字蓅IgD+ sIgM+B細(xì)胞只分泌IgM,而sIgD-sIgM-B細(xì)胞分泌IgG和IgA及一些IgM，提示：sIg和CD40的雙刺激導(dǎo)致B細(xì)胞分化。在以上的培養(yǎng)條件下，B細(xì)胞分泌大量的IL-6和IL-10，而IL-6和IL-10的拮抗劑能導(dǎo)致Ig的分泌抑制。另外，CD40與B細(xì)胞抗原受體（BCR）雙刺激信號(hào)在體外實(shí)驗(yàn)中引起靜止期B淋巴細(xì)胞表達(dá)生發(fā)中心（GC）細(xì)胞表型，包括CD38、CD95（FAS/APO-1）及羧肽酶M（CPM），其中發(fā)生中心表型CPM的出現(xiàn)是依賴BCR刺激的，而這些活化的B細(xì)胞，在去除CD40或BCR刺激后20小時(shí)后出現(xiàn)存活率降低現(xiàn)象6。在CD40激發(fā)的B細(xì)胞中增加IL-4或IL-13，IgM及IgG產(chǎn)量稍有增加，并且緊隨同種型轉(zhuǎn)換有IgE的分泌；在CD40被激發(fā)的B淋巴細(xì)胞中增中IL-10，結(jié)果有除IgE以外的相當(dāng)量的IgM、IgG及IgA的產(chǎn)生，這是分化到漿細(xì)胞的結(jié)果，IL-10能誘導(dǎo)CD40被激發(fā)的扁桃體B細(xì)胞分泌IgG1、IgG2及IgG3；CD40被激發(fā)的幼稚sIgD+sIgM+B細(xì)胞主要分泌IgM，但加IL-10后亦有IgG1及IgG3分泌，提示IL-10可能是某些IgG亞群的轉(zhuǎn)換因子7.。CD40被激發(fā)的幼稚sIgD+sIgM+B細(xì)胞加IL-10培養(yǎng)后產(chǎn)生低水平IgA，如同時(shí)增加TGF會(huì)誘導(dǎo)大量的IgA阻止IgM及IgC的產(chǎn)生8。因而，激活B細(xì)胞上的CD40啟動(dòng)了其同種轉(zhuǎn)移機(jī)制，其特異性最終由細(xì)胞因子決定。最近有學(xué)者報(bào)道，CD70（轉(zhuǎn)基因細(xì)胞）通過B細(xì)胞上CD27分子亦能阻止IL-10介導(dǎo)的B細(xì)胞凋亡。在與細(xì)胞因子的共同作用下，刺激B細(xì)胞抗原受體或激發(fā)其CD40分子，結(jié)果導(dǎo)致CD27分子表達(dá)，并得出結(jié)論：CD40/CD154相互作用發(fā)生在B細(xì)胞活化的早期相，并導(dǎo)致某個(gè)記憶B細(xì)胞池的擴(kuò)增。然后記憶B細(xì)胞通過活化的TH細(xì)胞經(jīng)由CD27/CD70途徑及一些細(xì)胞因子如IL-2、IL-10等分化成漿細(xì)胞8。3 CD40分子對(duì)B淋巴祖細(xì)胞的激發(fā)作用 可溶性抗CD40抗體既不激發(fā)正常的CD19+CD10+前體B細(xì)胞（BCP）增殖，亦不改變這群細(xì)胞已知的生長(zhǎng)信號(hào)，IL-4+CD40系統(tǒng)亦不能使CD19+CD10+ bCP生長(zhǎng)。然而IL-3+CD40系統(tǒng)能使CD19+CD10+ bCP生長(zhǎng)。激活的CD4+T細(xì)胞克隆表達(dá)的CD40L能激發(fā)BCP上的CD40誘導(dǎo)其擴(kuò)增9。用抗CD40單抗能阻斷這種T細(xì)胞依賴性BCP擴(kuò)增，高IgM綜合征病人T細(xì)胞克隆因表達(dá)非功能性CD40L，表明這個(gè)由CD40L提供的信號(hào)在B細(xì)胞分化中具有重要作用。但在上述兩培養(yǎng)體系中BCP并沒有分化成熟為sIg+B細(xì)胞。有趣的是，CD40的激發(fā)能導(dǎo)致BCP膜表面高水平的CD23表達(dá)。CD23分子涉及髓細(xì)胞的生成(myelopoiesis)及T細(xì)胞個(gè)體發(fā)生（ontogeny）。另外前體B細(xì)胞對(duì)CD40刺激的反應(yīng)可能擴(kuò)展到骨髓前體細(xì)胞，因其均高表達(dá)CD4010，在患有性聯(lián)高IgM綜合征的病人中經(jīng)常觀察到嗜中性白細(xì)胞減少癥（neutropenia）11，提示，在骨髓前體細(xì)胞上的CD20可能是功能性的。所以研究在骨髓微環(huán)境能否檢測(cè)到CD40L表達(dá)細(xì)胞以便最終證明CD40依賴的BCP激活的生理機(jī)制具有重要意義。4 CD40分子介導(dǎo)信號(hào)的有關(guān)分子機(jī)制 CD40是分子量48KD的細(xì)胞表面受體，表達(dá)于很多細(xì)胞類型，包括B細(xì)胞及抗原遞呈細(xì)胞，是型跨膜糖蛋白，其基因定位于20q11，屬神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（NGFR）/腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。該家族成員還有Fas（CD95）、CD27、CD30、OX40等，該家族被認(rèn)為在淋巴細(xì)胞抗原選擇方面起關(guān)鍵作用，這種作用具有雙向性，可以維持細(xì)胞存活，也可以誘導(dǎo)其凋亡12。在抗原特異性反應(yīng)中，T輔助細(xì)胞通過CD40配體激發(fā)生發(fā)中心細(xì)胞的CD40分子，使生發(fā)中心細(xì)胞免于凋亡。與此相反，經(jīng)由FAS/APO-1的信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Fas缺陷型小鼠患有自身免疫性綜合征，就是因?yàn)椴荒芮宄陨矸磻?yīng)性淋巴細(xì)胞13。在生發(fā)中心，B細(xì)胞CD40分子的激發(fā)引起Fas分子的表達(dá)，而經(jīng)由CD40及Fas的信號(hào)具有雙向協(xié)同作用，其作用的方向性由BCR調(diào)節(jié)；外源性抗原對(duì)其對(duì)應(yīng)BCR的強(qiáng)烈刺激，導(dǎo)致該B細(xì)胞克隆擴(kuò)增；相反，自身抗原對(duì)其對(duì)應(yīng)BCR的慢性刺激，導(dǎo)致該B細(xì)胞克隆凋亡；在親和力成熟過程中，BCR不能與抗原接觸的B細(xì)胞克隆亦將凋亡14。近年來，有關(guān)CD40信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制研究發(fā)展非常迅速，其研究主要是基于對(duì)惡性B淋巴細(xì)胞CD40分子激活后信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究。由于惡性細(xì)胞是正常細(xì)胞在某一分化階段惡變的結(jié)果，因此研究結(jié)果也就模擬了體內(nèi)正常B細(xì)胞的行為15。對(duì)非何杰金氏淋巴瘤（NHL）的研究表明，經(jīng)CD40活化后的NHL，上調(diào)性表達(dá)CD80和CD86以及其它一些粘附分子，成為功能性抗原遞呈細(xì)胞（APC），類似于正?；罨腂細(xì)胞16。神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體家族胞漿外區(qū)高度同源，均有很多保守的半胱氨酸殘基，并且都顯著地表達(dá)于造血細(xì)胞。而胞漿內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)部分相互差別很大。根據(jù)其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，可將該家族成員分成兩類，一類包括TNF-R1、Fas/APO-1、DR3、DR6、TRAIL-R1以及TRAIL-R2，其胞漿內(nèi)包含有能激活caspase酶的“死亡區(qū)”（death domain）;另一類包括TNF-R2、CD40、LT-R、CD27，其分子胞漿內(nèi)區(qū)段結(jié)構(gòu)很小，缺乏固有的death domain及蛋白酪氨酸激酶（PTK）活性。然而當(dāng)CD40胞外部分被激活后，通過一系列分子與CD40胞漿區(qū)段相互作用，發(fā)生廣泛的蛋白酪氨酸磷酸化、絲/蘇氨酸特異性蛋白激酶以及磷酸肌醇的激活?，F(xiàn)已證實(shí)，CD40分子的活化可能導(dǎo)致了內(nèi)源性TNF的自分泌并通過與TNR-R1結(jié)合而導(dǎo)致信號(hào)的傳導(dǎo)17。首先在確認(rèn)的兩個(gè)TNF受體相關(guān)蛋白TRAF1及TRAF2的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)另外一系列與CD40相關(guān)的成員即TRAF3、TRAF5、TRAF6，其中較為明確的為TRAF3，又稱為CD40bp或CRAF118。TRAF2和TRAF3蛋白與CD40胞漿區(qū)段相關(guān)，對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)非常重要。目前認(rèn)為，這些蛋白分子主要介導(dǎo)兩類不同信號(hào)，一類由TRAF1/TRAF2及TRAF6介導(dǎo)，導(dǎo)致B細(xì)胞活化并產(chǎn)生抗凋亡信號(hào)；另一類信號(hào)由TRAF3介導(dǎo)，與凋亡相關(guān)。CD40分子信號(hào)傳導(dǎo)過程中一個(gè)可能的分子事件是：在CD40未被激發(fā)時(shí)，TRAF以單體（monomers）存在，而當(dāng)CD40分子發(fā)生交聯(lián)后，TRAF發(fā)生多聚化(multimeriztion)。TRAF2和TRAF3蛋白的N末端鏈均包含一個(gè)鋅指狀基序（Zinc ring finger motif），這與其它DNA結(jié)合蛋白及轉(zhuǎn)錄調(diào)控予結(jié)構(gòu)類似，由此推斷TRAF蛋白的多聚，結(jié)果將導(dǎo)致NF-KB或NF-KB類似的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的激活19。同時(shí)，在CD40信號(hào)傳導(dǎo)過程中胞內(nèi)發(fā)生蛋白酪氨酸激酶（PTK）激活及絲/蘇氨酸磷酸化，并且與CD40相聯(lián)的TRAF的單體或多聚體是受絲/蘇氨酸激酶及CD40胞漿區(qū)磷酸化所調(diào)節(jié)。但TRAF多聚化與PTK激活之間相互作用機(jī)制尚未明確。對(duì)Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株的轉(zhuǎn)基因研究表明，CD40介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑與EB病毒基因轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)MPI介導(dǎo)的途徑有很多共同之處，為CD40傳導(dǎo)途徑的最終確定提供了重要參考手段20。業(yè)已證實(shí)，在B細(xì)胞發(fā)育所經(jīng)歷的不同分化階段中，一些信號(hào)元件、抑制物和受體可能表達(dá)，亦可能消失，有的會(huì)保持某種形式的“永生性”。說明在不同分化階段，信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)節(jié)途徑各不相同。CD40的激發(fā)亦可能導(dǎo)致多種胞內(nèi)信號(hào)途徑。而基因表達(dá)及調(diào)節(jié)的最終結(jié)果是直接涉及到細(xì)胞周期調(diào)控，如細(xì)胞周期依賴性激酶（cdk）基因等。在CD40介導(dǎo)的信號(hào)途徑中，涉及到Ig同種型轉(zhuǎn)換及T細(xì)胞活化有關(guān)的共刺激分子（如B7分子）的表達(dá)，因此B細(xì)胞中的CD40介導(dǎo)的信號(hào)最終直接誘導(dǎo)了NF-KB、NF-KB樣轉(zhuǎn)錄因子和AP-1、NF-AT等轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的表達(dá)。而B細(xì)胞活化的其它途徑包括BCR和細(xì)胞因子受體及一系列其它B細(xì)胞表面蛋白的信號(hào)，也可能就在轉(zhuǎn)錄水平與CD40信號(hào)途徑整合，最終導(dǎo)致B細(xì)胞作出相應(yīng)的反應(yīng)?？傊?，B細(xì)胞的發(fā)育與分化是經(jīng)歷多種途徑，而CD40介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑其細(xì)節(jié)仍待進(jìn)一步探討，何種蛋白-蛋白相互作用是CD40信號(hào)路徑與其它B細(xì)胞表面分子信號(hào)途徑的樞紐，仍是研究者們面臨的挑戰(zhàn)?；痦?xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助課題（No.39600056）作者簡(jiǎn)介：周照華（1968-），男（漢族），江蘇泰興人，蘇州醫(yī)學(xué)院講師，博士審校者：蘇州醫(yī)學(xué)院免疫研究室張學(xué)光參考文獻(xiàn) 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