KRAS和EGFR檢測(cè)與臨床應(yīng)用.ppt

KRAS和EGFR檢測(cè)與臨床應(yīng)用 匯報(bào)內(nèi)容 KRAS和EGFR的簡(jiǎn)介及臨床意義ARMS PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)等位特異性引物設(shè)計(jì)KRAS試劑盒開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)介 KRAS和EGFR的簡(jiǎn)介及臨床意義 KRAS背景 KRAS是一種原癌基因 長(zhǎng)約35kb 位于12號(hào)染色體 是RAS基因家族成員之一 編碼的蛋白主要參與PI3K PTEN AKT和RAF MEK ERK信號(hào)通路的調(diào)控 EGFR在通路中位于KRAS上游 配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸激酶活性 導(dǎo)致KRAS的活化和通路中信號(hào)傳導(dǎo) KRAS是許多惡性腫瘤的常見(jiàn)突變基因 胰腺癌 65 90 結(jié)直腸癌 40 肺癌 20 卵巢癌 15 KRAS基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效 KRAS基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從EGF抗體 西妥昔單抗 帕尼單抗 治療中獲益 而基因突變的患者治療效果很差 KRAS突變型患者對(duì)西妥昔單抗無(wú)應(yīng)答 其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者 KarapetisCS 2008 NEngJMed 結(jié)直腸癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南 歐洲藥品評(píng)估局 EMEA 2008 指出 KRAS野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益 而突變型患者受益較少 美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì) ASCO 2009 推薦 轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測(cè)KRAS突變 如有KRAS12 13位突變 則不應(yīng)進(jìn)行EGFR單克隆抗體治療 美國(guó)FDA指南推薦 在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前必須檢測(cè)KRAS基因的基因型 2012年7月6日批準(zhǔn)第一個(gè)用于結(jié)直腸癌的基因檢測(cè) Qiagen 以判斷西妥昔單抗是否有效 美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò) NCCN 2014 指南說(shuō) 轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行RAS突變檢測(cè) KRAS和NRAS 至少應(yīng)檢測(cè)KRAS第二外顯子的突變情況 KRAS或NRAS突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療 中國(guó)衛(wèi)生部于2010年10月14日發(fā)表了 結(jié)直腸癌診療規(guī)范 2010版 明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受西妥昔單抗 帕尼單抗時(shí) 必須檢測(cè)腫瘤組織的K ras基因狀態(tài) 在晚期 轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中 在治療前檢測(cè)腫瘤K ras基因狀態(tài) EGFR不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目 KRAS基因突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效 KRAS基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑 TKI 如吉非替尼 厄洛替尼 治療中獲益 而基因突變的患者易發(fā)生抵抗 KRAS突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后 其無(wú)癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者 圖中紅線所示 AndersonSM 2011 ExpertRev Mol DiagnEberhardDA 2005 JClinOncol 非小細(xì)胞肺癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南 美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò) NCCN 2009 指出 KRAS突變與非小細(xì)胞肺癌患者TKI抵抗有關(guān) KRAS基因測(cè)序有助于確定哪些病人適合TKI治療 當(dāng)KRAS基因發(fā)生了突變 則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)行分子靶向治療 KRAS主要突變位點(diǎn) 在結(jié)直腸癌中 KRAS突變主要發(fā)生于codon12 80 codon13 15 20 codon61和146 5 在肺癌中 約97 的KRAS突變發(fā)生于codon12 13 其余位于codon61和146 EGFR突變背景 EGFR基因位于染色體7p11 2 大小約200kb 是上皮生長(zhǎng)因子 EGF 細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體 EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的活性或細(xì)胞定位異常 與腫瘤細(xì)胞的增殖 血管生成 腫瘤侵襲 轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān) 非小細(xì)胞肺癌中EGFR突變率在北美和西歐為10 左右 而在東亞為30 50 其中在亞洲 女性 非吸煙 腺癌患者中EGFR突變率最高 達(dá)70 80 EGFR突變背景 研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變與吉非替尼 厄洛替尼的療效密切有關(guān) 其中EGFR突變的患者對(duì)吉非替尼 厄洛替尼治療敏感 有效率在80 以上 而EGFR野生型的患者的有效率在10 以下 吉非替尼 厄洛替尼作為一線藥物治療非小細(xì)胞肺癌 相比傳統(tǒng)的化療可以取得更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期 PFS 且副作用相對(duì)較小 患者容易耐受 但總體生存期 OS 并未延長(zhǎng) EGFR TKI目前主要用于非小細(xì)胞肺癌一線 二線和維持治療 我國(guó)大部分醫(yī)生將其用于二線 69 4 治療 41 7 的醫(yī)生將其用于一線治療 27 8 的醫(yī)生將其作為維持治療藥物 EGFR突變影響肺癌藥物療效 研究表明EGFR突變型患者使用吉非替尼的療效要優(yōu)于卡鉑與紫杉醇組合治療 而在野生型患者中則相反 使用吉非替尼的療效不如卡鉑與紫杉醇組合治療 MokT S 2009 NEngJMedMaemondoM 2010 NEngJMed EGFR突變檢測(cè)相關(guān)指南 美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò) NCCN 2011版的癌癥治療指南中明確指出 EGFR突變 尤其是外顯子19的缺失突變和外顯子21的L858R突變 與腫瘤對(duì)TKIs如吉非替尼治療敏感性有重要關(guān)系 而部分EGFR TKI初始治療有效的患者后期會(huì)發(fā)生耐藥 與EGFR外顯子20突變密切相關(guān) 美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì) ASCO 在JCO上發(fā)表報(bào)告 EGFR TKI是攜帶EGFR突變型的非小細(xì)胞肺癌病人的一線治療藥物 有益于進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌患者的個(gè)體化治療 歐洲EMEA指出 易瑞沙 吉非替尼 僅對(duì)攜帶EGFR突變型的非小細(xì)胞肺癌患者有效 平均無(wú)進(jìn)展生存期延長(zhǎng)3 5月 美國(guó)FDA 2013 批準(zhǔn)對(duì)擬采用阿法替尼 厄洛替尼等EGFR TKI治療的患者進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)的試劑盒 therascreenEGFRRGQPCRKit和cobas EGFRMutationTest 我國(guó) 非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南 中也明確指出EGFR突變 尤其是19號(hào)外顯子缺失突變與腫瘤對(duì)酪氨酸激酶抑制劑 TKIs 的敏感度有重要關(guān)系 對(duì)腺癌 大細(xì)胞癌 非小細(xì)胞肺癌等肺癌組織學(xué)類(lèi)型 EGFR檢測(cè)為一類(lèi)推薦 EGFR突變位點(diǎn) 常規(guī)檢測(cè)29個(gè) EGFR突變與EGFR TKI藥物療效關(guān)系 ADxEGFR試劑盒突變結(jié)果檢測(cè) ARMS PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn) ARMS PCR原理 ARMS是AmplificationRefractoryMutationSystem 擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng) 的縮寫(xiě) 根據(jù)PCR過(guò)程中要求引物和模板間的嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)突變位點(diǎn)的檢測(cè) 當(dāng)引物3 末端出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí) 產(chǎn)物將不能延伸 因此設(shè)計(jì)兩條上游 或下游 引物 使其3 末端分別與突變位點(diǎn)堿基匹配和錯(cuò)配 共用下游 或上游 引物 分別擴(kuò)增野生型和突變型目的片斷 ARMS PCR原理 TwoAllele Specific AS primers oneforeachalleleofaSNParedesigned TheASprimerscontainoneoftwopolymorphicnucleotidesattheprimer3 end Twosetsofprimers eitherforwardorreverseprimerscanbedesigned IfacommonreverseorforwardprimerisusedinaPCRreaction thereactioniscalledallele specificPCR AS PCR YouF M 2008 BMCBioinformatics PCR產(chǎn)物檢測(cè) RealtimePCR 每個(gè)PCR循環(huán)檢測(cè)熒光信號(hào) 不同PCR產(chǎn)物 不同熒光信號(hào)相比凝膠電泳 更快 可定量 無(wú)PCR產(chǎn)物污染信號(hào)產(chǎn)生方法 Scorpion Qiagen 雙環(huán)探針 廈門(mén)艾德 Taqman Molecularbeacons Sybrgreen Yo pro Figure2ThesensitivityofQuanTAS PCRforquantifyingJAK2mutantalleles ZapparoliG V 2013 BMCCancer 應(yīng)用于Realtime PCR的ARMS PCR ARMS技術(shù)特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 靈敏度高 0 1 1 操作簡(jiǎn)便周期短不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物污染適用樣本類(lèi)型多 如FFPE 精確突變類(lèi)型 缺點(diǎn) 方法建立需時(shí)較長(zhǎng)僅能檢測(cè)已知突變 測(cè)序法與ARMS法相比較 操作流程及數(shù)據(jù)解讀 檢測(cè)流程與質(zhì)量控制 標(biāo)本準(zhǔn)備 DNA抽提 突變檢測(cè) 分析報(bào)告 標(biāo)本種類(lèi)標(biāo)本量 SOPOD260 280 新鮮組織 qPCR FFPE SOP陽(yáng)性及陰性對(duì)照問(wèn)題及解決 SOP報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)判讀形式及檢查 使用ARMS的KRAS突變檢測(cè)試劑盒 使用ARMS的EGFR突變檢測(cè)試劑盒 等位特異性引物設(shè)計(jì) KRAS基因序列和常見(jiàn)突變 KRAS序列 atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag常見(jiàn)突變 三引物設(shè)計(jì)原理 YouF M 2008 BMCBioinformatics 三引物設(shè)計(jì) Atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag野生型引物 F 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTG 3 19nt 51 突變型引物 F 5 cttgtggtagttggagctA 3 19nt 49 下游引物 R 5 CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 25nt 54 三引物設(shè)計(jì) 下游引物設(shè)計(jì) ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG選擇序列 5 GACGAATATGATCCAACAATAGAGG 3 互補(bǔ)鏈 3 CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC 5 下游引物 5 CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 3 端增加錯(cuò)配 如果3 端是弱錯(cuò)配 C A或G T 則需要引入強(qiáng)的錯(cuò)配 A G或C T 才可阻斷3 端的擴(kuò)增 如果3 端是強(qiáng)錯(cuò)配 A G或C T 則需要引入弱的錯(cuò)配 C A或G T 或不需引入錯(cuò)配即可阻斷3 端的擴(kuò)增 當(dāng)3 端是中度錯(cuò)配 A A C C G G或T T 則需要引入中度的錯(cuò)配 野生型引物 F 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTG 3 突變型引物 F 5 cttgtggtagttggagcCT 3 下游引物 R 5 CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 四引物設(shè)計(jì) 四引物設(shè)計(jì) Atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag內(nèi)引物 F 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTA 3 內(nèi)引物 R 5 ACTCTTGCCTACGCCACC 3 外引物 F 5 AtgactgaatataaaCT 3 外引物 R 5 CTCTTGACCTGCTGTGTCG 3 KRAS試劑盒開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)介 KRAS突變探針和引物設(shè)計(jì) KRAS序列 atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag1 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTTA 3 12GGT GAT2 5 AAACTTGTGGTAGTTGGAGCGGT 3 12GGT GTT3 5 AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC 3 12GGT GCT4 5 ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA 3 12GGT AGT5 5 AACTTGTGGTAGTTGGAGCGT 3 12GGT TGT6 5 ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCCC 3 12GGT CGT7 5 GTGGTAGTTGGAGCTGGTAA 3 13GGC GAC8 參照引物 5 CTGAATATAAACTTGTGGTAGTT 3 9 下游引物 5 ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 TaqMan探針 5 FAM TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT BHQ1 3 鎖核酸阻滯探針 野生型 5 TGGAGCTGGTG