顯微鏡介紹,原理.doc

顯微鏡顯微鏡一般分為：光學顯微鏡、電子顯微鏡、探針顯微鏡1.光學顯微鏡：圖1-1-1現(xiàn)代普通光學顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像，故又常被稱為復式顯微鏡。它們由機械裝置和光學系統(tǒng)兩大部分組成。結構為：目鏡，鏡筒，轉換器，物鏡，載物臺，通光孔，遮光器，壓片夾，反光鏡，鏡座，粗準焦螺旋，細準焦螺旋，鏡臂，鏡柱，是顯微鏡的基本組成單位，主要是保證光學系統(tǒng)的準確配制和靈活調控，在一般情況下是固定不變的。而光學系統(tǒng)由物鏡、目鏡、聚光器等組成，直接影響著顯微鏡的性能，是顯微鏡的核心。一般的顯微鏡都可配置多種可互換的光學組件，通過這些組件的變換可改變顯微鏡的功能，如明視野、暗視野、相差等。光學顯微鏡的原理：當一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后相交于一點，這個點稱焦點，通過交點并垂直光軸的平面，稱焦平面。焦點有兩個，在物方空間的焦點，稱物方焦點，該處的焦平面，稱物方焦平面；反之，在象方空間的焦點，稱象方焦點，該處的焦平面，稱象方焦平面。 1. 當物體位于透鏡物方二倍焦距以外時，則在象方二倍焦距以內、焦點以外形成縮小的倒立實象； 2. 當物體位于透鏡物方二倍焦距上時，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實象；3. 當物體位于透鏡物方二倍焦距以內，焦點以外時，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實象；4. 當物體位于透鏡物方焦點上時，則象方不能成象；5. 當物體位于透鏡物方焦點以內時，則象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側比物體遠的位置形成放大的直立虛象。這是凸透鏡成像的基本原理，把物鏡與管鏡合稱為物鏡，將這兩種鏡片看做一組組合透鏡，就可以得到如圖的簡化光路圖dL圖1-1-2即，物體AB位于透鏡物方二倍焦距以內，焦點以外，在象方二倍焦距以外形成了放大的倒立實象A1B1而這個實像落在了目鏡的焦點以內，就在物體的同側形成了一個放大的“正立”的虛像，因為目鏡放大的并不是物體而是由物鏡放大后的倒立實像，因此我們得到的就是相對與原物體的倒立放大的虛像。顯微鏡對物體的放大，實際上就是對人觀察物體時視角的放大，因此顯微鏡的放大率取決于對視角的放大率如果有一臺顯微鏡，物鏡焦距為，目鏡焦距為，鏡筒長L，若最后的像成在離目鏡d處，試證明顯微鏡的放大率。顯微鏡的光路如圖1-1-2所示，AB經(jīng)物鏡成一放大實像，物鏡的長度放大率 因、相對L都較小。而且B很靠近，所以，即 位于目鏡的焦點內，經(jīng)目鏡成一放大的虛像（通常讓成在觀察者的明視距離d上）。因為都是近軸光線，所以此時觀察者從目鏡中看到的視角為 若觀察者不用顯微鏡，直接觀看AB的視角為 則顯微鏡的放大率m 不難看出目鏡的長度放大率為 所以有 顯微鏡的重要光學技術參數(shù)顯微鏡的光學技術參數(shù)包括：數(shù)值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆蓋差、工作距離等等。這些參數(shù)并不都是越高越好，它們之間是相互聯(lián)系又相互制約的，在使用時，應根據(jù)鏡檢的目的和實際情況來協(xié)調參數(shù)間的關系，但應以保證分辨率為準。1 數(shù)值孔徑數(shù)值孔徑簡寫NA，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術參數(shù)，是判斷兩者（尤其對物鏡而言）性能高低的重要標志。其數(shù)值的大小，分別標刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。數(shù)值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質的折射率（n）和孔徑角（u）半數(shù)的正弦之乘積。用公式表示如下：NA=nsinu/2孔徑角又稱鏡口角，是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度?？讖浇窃酱?，進入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點的距離成反比。顯微鏡觀察時，若想增大NA值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質的折射率n值。基于這一原理，就產生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質的折射率n值大于1，NA值就能大于1。數(shù)值孔徑最大值為1.4，這個數(shù)值在理論上和技術上都達到了極限。目前，有用折射率高的溴萘作介質，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。這里必須指出，為了充分發(fā)揮物鏡數(shù)值孔徑的作用，在觀察時，聚光鏡的NA值應等于或略大于物鏡的NA值。數(shù)值孔徑與其他技術參數(shù)有著密切的關系，它幾乎決定和影響著其他各項技術參數(shù)。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場寬度與工作距離都會相應地變小。2 分辨率顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個物點的最小間距，又稱鑒別率。其計算公式是=/NA式中為最小分辨距離；為光線的波長；NA為物鏡的數(shù)值孔徑。可見物鏡的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定。NA值越大，照明光線波長越短，則值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即減小值，可采取以下措施（1） 降低波長值，使用短波長光源。（2） 增大介質n值以提高NA值（NA=nsinu/2）。（3） 增大孔徑角u值以提高NA值。（4） 增加明暗反差。3 放大率和有效放大率由于經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率應該是物鏡放大率和目鏡放大率1的乘積：=1顯然，和放大鏡相比，顯微鏡可以具有高得多的放大率，并且通過調換不同放大率的物鏡和目鏡，能夠方便地改變顯微鏡的放大率。放大率也是顯微鏡的重要參數(shù)，但也不能盲目相信放大率越高越好。顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有聯(lián)系的概念。有關系式：500NA1000NA當選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時，顯微鏡不能分清物體的微細結構，此時即使過度地增大放大倍率，得到的也只能是一個輪廓雖大但細節(jié)不清的圖像，稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨的能力，但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力，應使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。 4 焦深焦深為焦點深度的簡稱，即在使用顯微鏡時，當焦點對準某一物體時，不僅位于該點平面上的各點都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內，也能看得清楚，這個清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其他技術參數(shù)有以下關系：（1） 焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔徑成反比。（2） 焦深大，分辨率降低。 由于低倍物鏡的景深較大，所以在低倍物鏡照相時造成困難。在顯微照相時將詳細介紹。5 視場直徑（Field Of View）觀察顯微鏡時，所看到的明亮的圓形范圍叫視場，它的大小是由目鏡里的視場光闌決定的。視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑愈大，愈便于觀察。有公式 F=FN/式中F: 視場直徑，F(xiàn)N：視場數(shù)（Field Number, 簡寫為FN，標刻在目鏡的鏡筒外側），:物鏡放大率。由公式可看出：（1） 視場直徑與視場數(shù)成正比。（2） 增大物鏡的倍數(shù)，則視場直徑減小。因此，若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。6 覆蓋差顯微鏡的光學系統(tǒng)也包括蓋玻片在內。由于蓋玻片的厚度不標準，光線從蓋玻片進入空氣產生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產生了相差，這就是覆蓋差。覆蓋差的產生影響了顯微鏡的成響質量。國際上規(guī)定，蓋玻片的標準厚度為0.17mm，許可范圍在0.16-0.18mm，在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計算在內。物鏡外殼上標的0.17，即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。 7 工作距離WD工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時，被檢物體應處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此，它與焦距是兩個概念，平時習慣所說的調焦，實際上是調節(jié)工作距離。 在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。物鏡物鏡是顯微鏡最重要的光學部件，利用光線使被檢物體第一次成象，因而直接關系和影響成象的質量和各項光學技術參數(shù)，是衡量一臺顯微鏡質量的首要標準。1 物鏡的主要參數(shù)（1） 放大率（2） 數(shù)值孔徑NA（3） 機械筒長L：在顯微鏡中，物鏡支承面到目鏡支承面之間的距離稱為機械筒長。對于一臺顯微鏡來說，機械筒長是固定的。我國規(guī)定機械筒長是160毫米。（4） 蓋玻片厚度d（5） 工作距離WD這些參數(shù)，大多刻在物鏡筒上，如圖3所示。有一種所謂筒長無限的顯微物鏡，這種物鏡的后方一般帶有輔助物鏡（也叫補償物鏡或鏡筒物鏡），被觀察物體位于物鏡前焦點上，經(jīng)過物鏡以后，成像在無限遠，再經(jīng)過輔助物鏡成像在輔助物鏡的焦平面上，如圖4所示。在物鏡和輔助物鏡之間是平行光，所以中間距離比較自由一些，可以加入棱鏡等光學元件。 物鏡的基本類型（1） 按顯微鏡鏡筒長度（以mm計）：透射光用160鏡筒，帶0.17mm厚或更厚的蓋玻片；反射光用190鏡筒，不帶蓋玻片；透射光與反射光用鏡筒，筒長無限大。（2） 按浸法特征：非浸式(干式)、浸式(油浸、水浸、甘油浸及其它浸法)。（3） 按光學裝置：透射式、反射式以及折反射式。（4） 按數(shù)值孔徑和放大倍數(shù)：低倍(NA0.2與10X)，中倍(NA0.65與40X)，高倍(NA0.65與40X)。（5） 按校正象差的情況不同，通常分為消色差物鏡，半復消色差物鏡，復消色差物鏡，平視場消色差物鏡，平視場復消色差物鏡和單色物鏡。a. 消色差物鏡（Achromatic objective）這是應用最廣泛的一類顯微物鏡，外殼上常有Ach字樣。它校正了軸上點的位置色差（紅，藍二色）、球差（黃綠光）和正弦差，保持了齊明條件。軸外點的象散不超過允許值(4屬光度)，二級光譜未校正。數(shù)值孔徑為0.10.15的低倍消色差物鏡一般由兩片透鏡膠合在一起的雙膠物鏡構成。數(shù)值孔徑至0.2的消色差物鏡由兩組雙膠透鏡構成。當數(shù)值孔徑增大到0.3時，再加入一平凸透鏡，該平凸透鏡決定著物鏡的焦距，而其它透鏡則補償由其平面與球面產生的象差。高倍物鏡的平面象差可用浸法消除。高倍消色差物鏡一般均為浸式，由四部分構成：前片透鏡、新月形透鏡及兩個雙膠透鏡組。b. 復消色差物鏡（Apochromatic objective）這類物鏡的結構復雜，透鏡采用了特種玻璃或螢石等材料制作而成，物鏡的外殼上標有Apo字樣。它對兩個色光實現(xiàn)了正弦條件，要求嚴格地校正軸上點的位置色差（紅，藍二色）、球差（紅，藍二色）和正弦差，同時要求校正二級光譜（再校正綠光的位置色差）。其倍率色差并不能完全校正，一般須用目鏡補償。由于對各種象差的校正極為完善，比響應倍率的消色差物鏡有更大的數(shù)值孔徑，這樣不僅分辨率高，象質量優(yōu)而且也有更高的有效放大率。因此，復消色差物鏡的性能很高，適用于高級研究鏡檢和顯微照相。c. 半復消色差物鏡（Semi apochromatic objective）半復消色差物鏡又稱氟石物鏡，物鏡的外殼上標有FL字樣。在結構上透鏡的數(shù)目比消色差物鏡多，比復消色差物鏡少，成象質量上，遠較消色差物鏡為好，接近于復消色差物鏡。d. 平視場物鏡（Plan objective ）平場物鏡是在物鏡的透鏡系統(tǒng)中增加一快半月形的厚透鏡，以達到校正場曲的缺陷，提高視場邊緣成像質量的目的。平場物鏡的視場平坦，更適用于鏡檢和顯微照相。對于平視場消色差物鏡，其倍率色差不大，不必用特殊目鏡補償。而平視場復消色差物鏡，則必須用目鏡來補償它的倍率色差。e. 單色物鏡這類物鏡由石英、熒石或氟化鋰制的一組單片透鏡構成。只能在紫外線光譜區(qū)的個別區(qū)內使用(寬度不超過20mm)，可見光譜區(qū)不能采用單色物鏡。這類物鏡均制成反射式與折反射式系統(tǒng)。主要缺點是相當大一部分光束在中心被遮蔽(入瞳面積的25%)。在新型折反射系統(tǒng)中，由于采用半透明反射鏡以及物鏡的膠合結構，使這一缺點大為減輕，從而可以取消反射鏡框的遮光。并且兩同軸反射鏡的殘余象差是互相補償?shù)?，同時用透鏡組來增大數(shù)值孔徑。若系統(tǒng)的校正滿意，孔徑達到NA=1.4時，中心遮蔽可不超過入瞳面積的4%。f. 特種物鏡所謂特種物鏡是在上述物鏡的基礎上，專門為達到某些特定的觀察效果而設計制造的。主要有以下幾種： (a) 帶校正環(huán)物鏡（Correction collar objective）在物鏡的中部裝有環(huán)裝的調節(jié)環(huán)，當轉動調節(jié)環(huán)時，可調節(jié)物鏡內透鏡組之間的距離，從而校正由蓋玻片厚度不標準引起的覆蓋差。調節(jié)環(huán)上的刻度可從0 .11-.023,在物鏡的外殼上也標科有此數(shù)字，表明可校正蓋玻片從0.11-0.23mm厚度之間的誤差。(b) 帶虹彩光闌的物鏡（Iris diaphragm objective）在物鏡鏡筒內的上部裝有虹彩光闌，外方也可以旋轉的調節(jié)環(huán)，轉動時可調節(jié)光闌孔徑的大小，這種結構的物鏡是高級的油浸物鏡，它的作用是在暗視場鏡檢時，往往由于某些原因而使照明光線進入物鏡，使視場背景不夠黑暗，造成鏡檢質量的下降。這時調節(jié)光闌的大小，使背景變黑，使被檢物體更明亮，增強鏡檢效果。 (c) 相襯物鏡（Phase contrast objective）這種物鏡是由于相襯鏡檢術的專用物鏡，其特點是在物鏡的后焦平面處裝有相板。(d) 無罩物鏡（No cover objective）有些被檢物體，如涂抹制片等，上面不能加用蓋玻片，這樣在鏡檢時應使用無罩物鏡，否則圖象質量將明顯下降，特別是在高倍鏡檢時更為明顯。這種物鏡的外殼上常標刻NC，同時在蓋玻片厚度的位置上沒有0.17的字樣，而標刻著0。(e) 長工作距離物鏡這種物鏡是倒置顯微鏡的專用物鏡，它是為了滿足組織培養(yǎng)，懸浮液等材料的鏡檢而設計。對于一個顯微鏡，目鏡只起一個放大的作用，分辨率等等參數(shù)都是由物鏡直接決定的。物鏡的鑒別能力：顯微鏡的鑒別能力主要決定于物鏡。物鏡的鑒別能力可分為平面和垂直鑒別能力。平面鑒別能力即物鏡的分辨率是指物鏡所具有的將顯微組織中兩物點清晰區(qū)分的最小距離d的能力。如1-5所示。根據(jù)光學衍射理論可知，顯微組織中的一點經(jīng)物鏡放大成像后并不能獲得一個真正的點像，而是具有相應尺寸的以白色圓斑為中心的許多個同心衍射環(huán)組成的。中心光斑的強度最大，而衍射環(huán)的光強度隨著環(huán)直徑增大而逐漸減弱。試樣上若有兩個點，如果兩點之間的距離小于d，則兩點放大成像后的衍射環(huán)中心部分也相互重迭而不能清晰分辨。只有當兩點間距大于或等于圖1-5 鑒別率與衍射環(huán)d才能清晰地分辨出來。d即為物鏡的分辨能力（鑒別率）。兩物點間最小距離d愈小，物鏡的分辨能力愈高。d=/2NA式中入射光的波長；NA物鏡的數(shù)值孔徑。在顯微鏡中，能充分利用物鏡分辨率的最低放大倍數(shù)稱為有效放大倍數(shù)。人眼在明視距離（250mm）處的分辨距離為0.150.30mm，因此，顯微鏡應將物鏡能分辨的最小距離d放大到0.150.30mm時方使其被人眼所分辨。若以Ma表示顯微鏡的有效放大倍數(shù)，則dMa=0.150.30mmMa=(0.30.6)NA/由此可知，顯微鏡的有效放大倍數(shù)是由物鏡的數(shù)值孔徑和入射光的波長決定的。若用黃綠色光（5.510-1mm）觀察，則Ma=（5001000）NA例如：選用NA=0.65的40倍物鏡，若入射光波長5.510-1mm時，則Ma=（5001000）NA=325650倍表1-2 物鏡的最小數(shù)值孔徑系列、參數(shù)、色圈及標志分類，色圈放大倍數(shù)1.62.546.310162540506380100代號消色差物鏡數(shù)值孔徑0.100.250.400.650.851.25平面消色差物鏡0.040.070.100.150.250.320.400.650.750.850.951.25PC平面半復消色差物鏡0.200.300.400.600.750.901.30PB平面復消色差物鏡0.160.200.300.400.650.800.951.32PF色圈黑黑藍藍紫綠綠黃黃紅紅白因此，應選擇1020倍目鏡相配合。如目鏡倍數(shù)低于10倍，則未能充分發(fā)揮物鏡的分辨能力；如果目鏡倍數(shù)高于20倍，將會產生虛放大。垂直鑒別能力即物鏡垂直分辨率又稱景深，是指物鏡所具有在景深方面能清晰造像的能力，即垂直方面能清晰造像的最大景深深度，深度越大表示垂直鑒別率越大。景深h為: h=n/(NA)M（0.150.30）由此可見，物鏡的垂直鑒別率與數(shù)值孔徑、放大倍數(shù)成反比，要提高景深，最好選用數(shù)值孔徑小的物鏡或減小孔徑光闌以縮小物鏡的工作孔徑，但這樣就會降低物鏡的分辨能力.。所以要調和這一矛盾只能視具體情況而定。顯微鏡的鑒別能力顯微鏡的鑒別能力是顯微鏡最重要的特性，它是指顯微鏡對于試樣上最細微部分所能獲得清晰映象的能力，通常用可以辨別的物體上兩點間的最小距離d來表示。被分辨的距離越短，表示顯微鏡的鑒別能力越高。顯微鏡的鑒別能力可由下式求得：d=/2NA式中：入射光源的波長；NA物鏡的數(shù)值孔徑，表示物鏡的聚光能力?？梢?，波長越短，數(shù)值孔徑越大，鑒別能力就越高，在顯微鏡中就能看到更細微的部分。一般物鏡與物體之間的介質是空氣，光線在空氣中的折射率n=1，若一物鏡的角孔徑為60，則其數(shù)值孔徑為NA=nsin=1sin30=0.5若在物鏡與試樣之間滴入一種松柏油（n=1.52），則其數(shù)值孔徑為：NA=1.52sin30=0.76物鏡在設計和使用中指定以空氣為介質的稱為“干系物鏡”（或干物鏡），以油為介質的稱為“油浸系物鏡”（或油物鏡）。從圖1-7可以看出，油物鏡具有較高的數(shù)值孔徑，因為透過油進入到物鏡的光線比透過空氣進入的多，使物鏡的聚光能力增強，從而提高物鏡的鑒別能力。物鏡物鏡試樣試樣R2R1R1R2R1R1R2R2jj=300 空氣n=1 油n=1.52（a）干物鏡 （b）油物鏡圖1-7 不同介質對物鏡聚光能力的比較以上是光學顯微鏡一些重要的性質與光學原理，以下是光學顯微鏡幾種特殊情況，或者說具有更特異性功能的光學顯微鏡：暗視野顯微鏡明視野顯微鏡的的照明光線直接進入視野，屬透射照明。生活的細菌在明視野顯微鏡下觀察是透明的，不易看清。而暗視野顯微鏡則利用特殊的聚光器實現(xiàn)斜射照明，給樣品照明的光不直接穿過物鏡，而是由樣品反射或折射后再進入物鏡（圖 2-9），因此，整個視野是暗的，而樣品是明亮的。正如我們在白天看不到的星辰卻可在黑暗的夜空中清楚地顯現(xiàn)一樣，在暗視野顯微鏡中由于樣品與背景之間的反差增大，可以清晰地觀察到在明視野顯微鏡中不易看清的活菌體等透明的微小顆粒。而且，即使所觀察微粒的尺寸小于顯微鏡的分辨率，依然可以通過它們散射的光而發(fā)現(xiàn)其存在。因此，暗視野法主要用于觀察生活細菌的運動性。相差顯微鏡光線通過比較透明的標本時，光的波長（顏色）和振幅（亮度）都沒有明顯的變化，因此，用普通光學顯微鏡觀察未經(jīng)染色的標本（如活的細胞）時，其形態(tài)和內部結構往往難以分辨。然而，由于細胞各部分的折射率和厚度的不同，光線通過這種標本時，直射光和衍射光的光程就會有差別。隨著光程的增加或減少，加快或落后的光波的相位會發(fā)生改變（產生相位差）。光的相位差人肉眼感覺不到，但相差顯微鏡配備有特殊的光學裝置環(huán)狀光闌和相差板，利用光的干涉現(xiàn)象，能將光的相位差轉變?yōu)槿搜劭梢圆煊X的振幅差（明暗差），從而使原來透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對比度增強。正由于樣品的這種反差是以不同部位的密度差別為基礎形成的，因此，相差顯微鏡使人們能在不染色的情況下比較清楚地觀察到在普通光學顯微鏡和暗視野顯微鏡下都看不到或看不清的活細胞及細胞內的某些細微結構。它比通常的顯微鏡要增加下列附件： (1) 裝有相位板(相位環(huán)形板)的物鏡，相位差物鏡。 (2) 附有相位環(huán)(環(huán)形縫板)的聚光鏡，相位差聚光鏡。 (3) 單色濾光鏡-(綠)。 各種元件的性能說明 (1) 相位板使直接光的相位移動 90，并且吸收減弱光的強度，在物鏡后焦平面的適當位置裝置相位板，相位板必須確保亮度，為使衍射光的影響少一些，相位板做成環(huán)形狀。 (2) 相位環(huán)(環(huán)狀光圈)是根據(jù)每種物鏡的倍率，而有大小不同，可用轉盤器更換。 (3) 單色濾光鏡系用中心波長546nm(毫微米)的綠色濾光鏡。通常是用單色濾光鏡入觀察。相位板用特定的波長，移動90看直接光的相位。當需要特定波長時，必須選擇適當?shù)臑V光鏡，濾光鏡插入后對比度就提高。此外，相位環(huán)形縫的中心，必須調整到正確方位后方能操作，對中望遠鏡就是起這個作用部件。熒光顯微鏡有些化合物（熒光素）可以吸收紫外線并轉放出一部分為光波較長的可見光，這種現(xiàn)象稱為熒光。因此，在紫外線的照射下，發(fā)熒光的物體會在黑暗的背景下表現(xiàn)為光亮的有色物體，這就是熒光顯微技術的原理。由于不同熒光素的激發(fā)波長范圍不同，因此同一樣品可以同時用二種以上的熒光素標記，它們在熒光顯微鏡下經(jīng)過一定波長的光激發(fā)發(fā)射出不同顏色的光。熒光顯微技術在免疫學、環(huán)境微生物學、分子生物學中應用十分普遍。在螢光顯微鏡上，必須在標本的照明光中，選擇出特定波長的激發(fā)光，以產生熒光，然后必須在激發(fā)光和熒光混合的光線中，單把熒光分離出來以供觀察。因此，在選擇特定波長中，濾光鏡系統(tǒng)，成為極其重要的角色。 熒光顯微鏡原理： (A) 光源：光源輻射出各種波長的光(以紫外至紅外)。 (B) 激勵濾光源：透過能使標本產生螢光的特定波長的光，同時阻擋對激發(fā)螢光無用的光。 (C) 熒光標本：一般用熒光色素染色。 (D) 阻擋濾光鏡：阻擋掉沒有被標本吸收的激發(fā)光有選擇地透射熒光，在熒光中也有部分波長被選擇透過。 以紫外線為光源，使被照射的物體發(fā)出熒光的顯微鏡。偏光顯微鏡偏光顯微鏡是用于研究所謂透明與不透明各向異性材料的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質，在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚，當然這些物質也可用染色法來進行觀察，但有些則不可能，而必須利用偏光顯微鏡。 （1）偏光顯微鏡的特點 將普通光改變?yōu)槠窆膺M行鏡檢的方法，以鑒別某一物質是單折射（各向同行）或雙折射性（光束入射到各向異性的晶體，分解為兩束光而沿不同方向折射的現(xiàn)象。它們?yōu)檎駝臃较蚧ハ啻怪钡木€偏振光。這樣的晶體可以理解為不均勻介質）。雙折射性是晶體的基本特性。因此，偏光顯微鏡被廣泛地應用在礦物、化學等領域，在生物學和植物學也有應用。 （2）偏光顯微鏡的基本原理 偏光顯微鏡的原理比較復雜，在此不作過多介紹,偏光顯微鏡必須具備以下附件：起偏鏡，檢偏鏡，補償器或相位片，專用無應力物鏡，旋轉載物臺。共聚焦顯微鏡從一個點光源發(fā)射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上，如果物體恰在焦點上，那么反射光通過原透鏡應當匯聚回到光源，這就是所謂的共聚焦，簡稱共焦。激光掃描共聚焦顯微鏡Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡(dichroic mirror)，將已經(jīng)通過透鏡的反射光折向其它方向，在其焦點上有一個帶有針孔(Pinhole)，小孔就位于焦點處，擋板后面是一個 光電倍增管(photomultiplier tube，PMT)?？梢韵胂瘢綔y光焦點前后的反射光通過這一套共焦系統(tǒng)，必不能聚焦到小孔上，會被擋板擋住。于是光度計測量的就是焦點處的反射光強度。其意義是：通過移動透鏡系統(tǒng)可以對一個半透明的物體進行三維掃描。金相顯微鏡金相顯微鏡是對金屬內部結構進行分析與鑒定的顯微鏡，對鏡片要求較高。上面提到的濾光鏡片等等參數(shù)實際上是在金相顯微鏡中的細致要求，一般的生物學觀測并不局限于上面的細致的規(guī)定，但成像原理并無區(qū)別2.電子顯微鏡透射電子顯微鏡圖1.3圖1.2透射電子顯微鏡的光路原理圖因電子束穿透樣品后，再用電子透鏡成像放大而得名。，由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機制作。電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達近百萬倍、由照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)5部分構成，如果細分的話：主體部分是電子透鏡和顯像記錄系統(tǒng)，由置于真空中的電子槍、聚光鏡、物樣室、 物鏡、衍射鏡、中間鏡、 投影鏡、熒光屏和照相機。電子光學部分整個電子光學部分完全置于鏡筒之內，自上而下順序排列著電子槍、聚光鏡、樣品室、 物鏡、中間鏡、投影鏡、觀察室、熒光屏、照相機構等裝置。根據(jù)這些裝置的功能不同又可將電子光學部分分為照明系統(tǒng)、樣品室、成像系統(tǒng)及圖像觀察和記錄系統(tǒng)。圖1.3為透射電子顯微鏡電子光學部分示意圖。1照明系統(tǒng)照明系統(tǒng)由電子槍、聚光鏡和相應的平移對中及傾斜調節(jié)裝置組成。它的作用：是為成像系統(tǒng)提供 一束亮度高、相干性好的照明光源。為滿足暗場成像的需要照明電子束可在2-3度范圍內傾斜。電子槍。它由陰極、柵極和陽極構成。 在真空中通電加熱后使從陰極發(fā)射的電子獲得較高的動能形成定向高速電子流。聚光鏡。聚光鏡的作用是會聚從電子槍發(fā)射出來的電子束，控制照明孔徑角、電流密度和光斑尺寸。圖1.4 照明系統(tǒng)示意圖 2樣品室樣品室中有樣品桿、樣品杯及樣品臺。其位于照明部分和物鏡之間，它的主要作用是通過試樣臺承載試樣，移動試樣。 3成像系統(tǒng) 一般由物鏡、中間鏡和投影鏡組成。中間鏡和投影鏡的作用是將來自物鏡的圖像進一步放大。成像系統(tǒng)補充說明：a) 由物鏡、中間鏡(1、2個)和投影鏡(1、2個)組成。b) 成像系統(tǒng)的兩個基本操作是將衍射花樣或圖像投影到熒光屏上。c) 通過調整中間鏡的透鏡電流，使中間鏡的物平面與物鏡的背焦面重合，可在熒光屏上得到衍射花樣。d) 若使中間鏡的物平面與物鏡的像平面重合則得到顯微像。圖1.5 透射電鏡成像系統(tǒng)的兩種基本操作：（a）將衍射譜投影到熒光屏；（b）將顯微像投影到熒光屏4圖像觀察與記錄系統(tǒng) 該系統(tǒng)由熒光屏、照相機、數(shù)據(jù)顯示等組成在分析電鏡中，還有探測器和電子能量分析等附件，見圖1.6。圖1.6 透射電鏡圖像觀察與記錄系統(tǒng)示意圖1.1.2真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)由機械泵、油擴散泵、換向閥門、真空測量儀泵及真空管道組成。它的作用是排除鏡筒內氣體，使鏡筒真空度至少要在10-3 pa以上。如果真空度低的話，電子與氣體分子之間的碰撞引起散射而影響襯度，還會使電子柵極與陽極間高壓電離導致極間放電，殘余的氣體還會腐蝕燈絲，污染樣品。 1.1.3供電控制系統(tǒng)加速電壓和透鏡磁電流不穩(wěn)定將會產生嚴重的色差及降低電鏡的分辨本領，所以加速電壓和透鏡電流的穩(wěn)定度是衡量電鏡性能好壞的一個重要標準。透射電鏡的電路主要由高壓直流電源、透鏡勵磁電源、偏轉器線圈電源、電子槍燈絲加熱電源，以及真空系統(tǒng)控制電路、真空泵電源、照相驅動裝置及自動曝光電路等部分組成。另外，許多高性能的電鏡上還裝備有掃描附件、能譜議、電子能量損失譜等儀器。它的光路與光學顯微鏡相仿，可以直接獲得一個樣本的投影。通過改變物鏡的透鏡系統(tǒng)人們可以直接放大物鏡的焦點的像。由此人們可以獲得電子衍射像。使用這個像可以分析樣本的晶體結構。在這種電子顯微鏡中，圖像細節(jié)的對比度是由樣品的原子對電子束的散射形成的。由于電子需要穿過樣本，因此樣本必須非常薄。組成樣本的原子的原子量、加速電子的電壓和所希望獲得的分辨率決定樣本的厚度。樣本的厚度可以從數(shù)納米到數(shù)微米不等。原子量越高、電壓越低，樣本就必須越薄。樣品較薄或密度較低的部分，電子束散射較少，這樣就有較多的電子通過物鏡光欄，參與成像，在圖像中顯得較亮。反之，樣品中較厚或較密的部分，在圖像中則顯得較暗。如果樣品太厚或過密，則像的對比度就會惡化，甚至會因吸收電子束的能量而被損傷或破壞。 透射式電子顯微鏡鏡筒的頂部是電子槍，電子由鎢絲熱陰極發(fā)射出、通過第一，第二兩個聚光鏡使電子束聚焦。電子束通過樣品后由物鏡成像于中間鏡上，再通過中間鏡和投影鏡逐級放大，成像于熒光屏或照相干版上。中間鏡主要通過對勵磁電流的調節(jié)，放大倍數(shù)可從幾十倍連續(xù)地變化到幾十萬倍；改變中間鏡的焦距，即可在同一樣品的微小部位上得到電子顯微像和電子衍射圖像。為了能研究較厚的金屬切片樣品，法國杜洛斯電子光學實驗室研制出加速電壓為3500千伏的超高壓電子顯微鏡。 在能量過濾透過式電子顯微鏡（Energy Filtered Transmission Electron Microscopy，EFTEM）中人們測量電子通過樣本時的速度改變。由此可以推測出樣本的化學組成，比如化學元素在樣本內的分布。關于衍射的原理，簡單的引入惠更斯菲涅爾原理（1）惠更斯原理圖2-1-33惠更斯指出，由光源發(fā)出的光波，在同一時刻t時它所達到的各點的集合所構成的面，叫做此時刻的波陣面（又稱為波前），在同一波陣面上各點的相位都相同，且波陣面上的各點又都作為新的波源向外發(fā)射子波，子波相遇時可以互相疊加，歷時t后，這些子波的包絡面就是t+t時刻的新的波陣面。波的傳播方向與波陣面垂直，波陣面是一個平面的波叫做平面波，其傳播方向與此平面垂直，波陣面是一個球面（或球面的一部分）的波叫做球面波，其傳播方向為沿球面的半徑方向,如圖2-1-33（2）菲涅耳對惠更斯原理的改進（惠菲原理）波面S上每個面積單元都可看作新的波源，它們均發(fā)出次波，波面前方空間某一點P的振動可以由S面上所有面積所發(fā)出的次波在該點迭加后的合振幅來表示。面積元ds所發(fā)出各次波的振幅和位相符合下列四個假設：在波動理論中，波面是一個等位相面，因而可以認為面上名點所發(fā)出的所有次波都有相同的初位相（可令）。SPN圖2-1-34次波在P點處的振幅與r成反比。從面積元所發(fā)出的次波的振幅正比于的面積，且與傾角有關，其中為ds的法線N與ds到P點的連線r之間的夾角，即從ds發(fā)出的次波到達P點時的振幅隨的增大而減?。▋A斜因數(shù)）。次波在P點處的位相，由光程決定 。也就是說，一束波穿過一個縫之后，就相當于以這個縫上的點為波源重新向外發(fā)出與原來等速的子波，而子波到底以多大的張角向什么方向發(fā)出，是子波之間共同干涉的結果，涉及到E=CK()/rcos2（t/T-r/）dS這個公式，是一個傾斜因子函數(shù)，不加以解釋。掃描電子顯微鏡掃描電鏡的電子束不穿過樣品，僅以電子束盡量聚焦在樣本的一小塊地方，然后一行一行地掃描樣本。入射的電子導致樣本表面被激發(fā)出次級電子。顯微鏡觀察的是這些每個點散射出來的電子，放在樣品旁的閃爍晶體接收這些次級電子，通過放大后調制顯像管的電子束強度，從而改變顯像管熒光屏上的亮度。顯像管的偏轉線圈與樣品表面上的電子束保持同步掃描，這樣顯像管的熒光屏就顯示出樣品表面的形貌圖像，這與工業(yè)電視機的工作原理相類似。由于這樣的顯微鏡中電子不必透射樣本，因此其電子加速的電壓不必非常高。 掃描式電子顯微鏡的分辨率主要決定于樣品表面上電子束的直徑。放大倍數(shù)是顯像管上掃描幅度與樣品上掃描幅度之比，可從幾十倍連續(xù)地變化到幾十萬倍。掃描式電子顯微鏡不需要很薄的樣品；圖像有很強的立體感；能利用電子束與物質相互作用而產生的次級電子、吸收電子和X射線等信息分析物質成分。 掃描式電子顯微鏡的電子槍和聚光鏡與透射式電子顯微鏡的大致相同，但是為了使電子束更細，在聚光鏡下又增加了物鏡和消像散器，在物鏡內部還裝有兩組互相垂直的掃描線圈。物鏡下面的樣品室內裝有可以移動、轉動和傾斜的樣品臺。 場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM）是一種比較簡單的掃描電子顯微鏡，它觀察樣本上因強電場導致的場發(fā)射所散發(fā)出來的電子。 假如觀察的是透過樣本的掃描電子的話，那么這種顯微鏡被稱為掃描透射電子顯微鏡（Scanning Transmission Electron Microscopy，STEM）掃描電子顯微鏡由三大部分組成：真空系統(tǒng)，電子束系統(tǒng)以及成像系統(tǒng)。真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)主要包括真空泵和真空柱兩部分。真空柱是一個密封的柱形容器。 真空泵用來在真空柱內產生真空。有機械泵、油擴散泵以及渦輪分子泵三大類，機械泵加油擴散泵的組合可以滿足配置鎢槍的SEM的真空要求，但對于裝置了場致發(fā)射槍或六硼化鑭槍的SEM,則需要機械泵加渦輪分子泵的組合。 成象系統(tǒng)和電子束系統(tǒng)均內置在真空柱中。真空柱底端即為右圖所示的密封室，用于放置樣品。之所以要用真空，主要基于以下兩點原因： 電子束系統(tǒng)中的燈絲在普通大氣中會迅速氧化而失效，所以除了在使用SEM時需要用真空以外，平時還需要以純氮氣或惰性氣體充滿整個真空柱。 為了增大電子的平均自由程，從而使得用于成象的電子更多。 1.2電子束系統(tǒng) 電子束系統(tǒng)由電子槍和電磁透鏡兩部分組成，主要用于產生一束能量分布極窄的、電子能量確定的電子束用以掃描成象。 電子槍 電子槍用于產生電子，主要有兩大類，共三種。 一類是利用場致發(fā)射效應產生電子，稱為場致發(fā)射電子槍。這種電子槍極其昂貴，在十萬美元以上，且需要小于10-10torr的極高真空。但它具有至少1000小時以上的壽命，且不需要電磁透鏡系統(tǒng)。 另一類則是利用熱發(fā)射效應產生電子，有鎢槍和六硼化鑭槍兩種。鎢槍壽命在30100小時之間，價格便宜，但成象不如其他兩種明亮，常作為廉價或標準SEM配置。六硼化鑭槍壽命介于場致發(fā)射電子槍與鎢槍之間，為2001000小時，價格約為鎢槍的十倍，圖像比鎢槍明亮510倍，需要略高于鎢槍的真空，一般在10-7torr以上；但比鎢槍容易產生過度飽和和熱激發(fā)問題。 電磁透鏡 熱發(fā)射電子需要電磁透鏡來成束，所以在用熱發(fā)射電子槍的SEM上，電磁透鏡必不可少。通常會裝配兩組： 匯聚透鏡：顧名思義，匯聚透鏡用匯聚電子束，裝配在真空柱中，位于電子槍之下。通常不止一個，并有一組匯聚光圈與之相配。但匯聚透鏡僅僅用于匯聚電子束，與成象會焦無關。 物鏡：物鏡為真空柱中最下方的一個電磁透鏡，它負責將電子束的焦點匯聚到樣品表面。 1.3成像系統(tǒng) 電子經(jīng)過一系列電磁透鏡成束后，打到樣品上與樣品相互作用，會產生次級電子、背散射電子、歐革電子以及X射線等一系列信號。所以需要不同的探測器譬如次級電子探測器、X射線能譜分析儀等來區(qū)分這些信號以獲得所需要的信息。雖然X射線信號不能用于成象，但習慣上，仍然將X射線分析系統(tǒng)劃分到成象系統(tǒng)中。 。3.探針顯微鏡原子力顯微鏡（1）原子力顯微鏡結構 AFM的原理較為簡單，它是用微小探針“摸索”樣品表面來獲得信息如圖1所示，當針尖接近樣品時，針尖受到力的作用使懸臂發(fā)生偏轉或振幅改變。懸臂的這種變化經(jīng)檢測系統(tǒng)檢測后轉變成電信號傳遞給反饋系統(tǒng)和成像系統(tǒng)，記錄掃描過程中一系列探針變化就可以獲得樣品表面信息圖像。圖1下面分別介紹檢測系統(tǒng)、掃描系統(tǒng)和反饋控制系統(tǒng)。1. 檢測系統(tǒng) 懸臂的偏轉或振幅改變可以通過多種方法檢測，包括：光反射法、光干涉法、隧道電流法、電容檢測法等。目前AFM系統(tǒng)中常用的是激光反射檢測系統(tǒng)，它具有簡便靈敏的特點。激光反射檢測系統(tǒng)由探針、激光發(fā)生器和光檢測器組成.2. 探針 探針是AFM檢測系統(tǒng)的關鍵部分。它由懸臂和懸臂末端的針尖組成隨著精細加工技術的發(fā)展，人們已經(jīng)能制造出各種形狀和特殊要求的探針。懸臂是由Si或Si3N4經(jīng)光刻技術加工而成的。懸臂的背面鍍有一層金屬以達到鏡面反射。在接觸式AFM中V形懸臂是常見的一種類型(如圖2所示)。圖2 它的優(yōu)點是具有低的垂直反射機械力阻和高的側向扭曲機械力阻。懸臂的彈性系數(shù)一般低于固體原于的彈性系數(shù)，懸臂的彈性常數(shù)與形狀、大小和材料有關。厚而短的懸臂具有硬度大和振動頻率高的特點。3. 光電檢測器AFM光信號檢測是通過光電檢測器來完成的。激光由光源發(fā)出照在金屬包覆的懸臀上，經(jīng)反射后進入光電二極管檢測系統(tǒng)。然后，通過電子線路把照在兩個二極管上的光量差轉換成電壓信號方式來指示光點位置。4. 掃描系統(tǒng) AFM對樣品掃描的精確控制是靠掃描器來實現(xiàn)的。掃描器中裝有壓電轉換器。壓電裝置在X，Y，Z三個方向上精確控制樣品或探針位置。目前構成掃描器的基質材料主要是鈦鋯酸鉛Pb(Ti,Zr)O3制成的壓電陶瓷材料。壓電陶瓷有壓電效應，即在加電壓時有收縮特性，并且收縮的程度與所加電壓成比例關系。壓電陶瓷能將1mv1000V的電壓信號轉換成十幾分之一納米到幾微米的位移。 5. 反饋控制系統(tǒng) AFM反饋控制是由電子線路和計算機系統(tǒng)共同完成的。AFM的運行是在高速、功能強大的計算機控制下來實現(xiàn)的?？刂葡到y(tǒng)主要有兩個功能：(1)提供控制壓電轉換器X-Y方向掃描的驅動電壓；(2)在恒力模式下維持來自顯微鏡檢測環(huán)路