「《產(chǎn)淀粉酶菌的分離純化》實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)」.doc

產(chǎn)淀粉酶菌株的分離純化一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 掌握產(chǎn)淀粉酶菌種的分離純化的原理和方法技術(shù)； 2. 鞏固十倍稀釋法。二、 實(shí)驗(yàn)原理土壤是微生物生活的大本營(yíng)，是尋找有重要應(yīng)用潛力的微生物主要的菌源。因此本實(shí)驗(yàn)選擇從土壤中分離出產(chǎn)淀粉酶菌種，再進(jìn)行純培養(yǎng)。主要運(yùn)用富集培養(yǎng)技術(shù)，稀釋涂布平板法和平板劃線分離法及無(wú)菌操作技術(shù)獲得我們所需要的產(chǎn)淀粉酶菌種。淀粉酶作用于淀粉時(shí)，打開了淀粉分子的糖苷鍵，從而使淀粉失去粘性，同時(shí)使其失去了與碘的顯色反應(yīng)能力，不再與碘結(jié)合，從而形成透明圈。產(chǎn)淀粉酶菌株在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，會(huì)水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤為明顯。三、 實(shí)驗(yàn)材料1. 菌種： 從自然界篩選獲得的淀粉酶產(chǎn)生菌種2. 土壤樣品： 從栽種土豆的菜園中采集土壤樣品3. 培養(yǎng)基：淀粉液體培養(yǎng)基（50mL）： 蛋白胨 0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉 0.1g，蒸溜水 50mL。淀粉瓊脂培養(yǎng)基 (200mL)： 蛋白胨 2g，NaCl 1g，牛肉膏 1g，可溶性淀粉 0.4g，蒸溜水 200mL，瓊脂 3-4g。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 (200mL)： 蛋白胨 2g，牛肉膏 0.6g，NaCl 1g，瓊脂 3-4g，蒸餾水 200mL，pH7.0-7.2。4. 其他用品：酒精燈、移液槍（20-200uL）、接種環(huán)、試管架、三角涂布棒（各一個(gè)），電子天平、三角燒瓶（5個(gè)）、試管（10支）、培養(yǎng)皿（15個(gè)）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、無(wú)菌水（200mL）、微波爐、盧戈氏碘液。四、 試驗(yàn)方法1樣品采集 用無(wú)菌報(bào)紙，在栽有土豆的菜園里，從不同的采樣點(diǎn)采取土樣約15g。（注意應(yīng)采取距地表2-3cm以下的土樣）2富集培養(yǎng)取土樣10g，放入盛90mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振動(dòng)20min，使土樣與水充分混合，使微生物分散開。用一支1mL的移液管移取1mL土樣液，加入到盛有50mL淀粉液體培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行富集培養(yǎng)，搖床110r/min，37，培養(yǎng)24h。3涂布平板分離倒平板 將淀粉瓊脂培養(yǎng)基融化后倒平板（12個(gè)），每平板約15ml。（注意平皿中的培養(yǎng)基厚度要均勻）土壤稀釋液的制備 取富集培養(yǎng)液1mL，放入盛9mL無(wú)菌水的試管中，充分振勻，此為10-1稀釋液，以此類推制成10-2 ，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7和10-8幾種稀釋度的土壤溶液。涂布 將上述培養(yǎng)基的平板底部用記號(hào)筆分別寫上10-5，10-6，10-7和10-8四種稀釋度字樣，每種培養(yǎng)基每種稀釋度標(biāo)記3皿，然后用移液槍分別由10-5，10-6，10-7和10-8四種土樣稀釋液中吸取0.1ml菌液放入寫好稀釋度的平板中央位置，用無(wú)菌涂布棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂滿整個(gè)平面，室溫下靜置5-10min。培養(yǎng)將平板倒置在37溫箱中培養(yǎng)48h。4. 檢測(cè) 觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，打開平板蓋子，加入少量盧戈氏碘液于平板中，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液鋪滿整個(gè)平板，觀察是否有水解圈的產(chǎn)生。5產(chǎn)淀粉酶菌株的純化倒平板 將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板（12個(gè)），每平板約15mL（注意平皿中的培養(yǎng)基厚度要均勻）平板劃線選擇在10-5，10-6，10-7和10-8四個(gè)稀釋度下，每組淀粉瓊脂培養(yǎng)基中產(chǎn)生透明圈最大的1個(gè)菌落，用無(wú)菌水將碘液沖洗掉，挑取遠(yuǎn)離透明圈的少許菌苔，在3個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線接種。培養(yǎng)將平板倒置在37溫箱中培養(yǎng)48h。6鑒定保存觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，打開平板蓋子，加入少量盧戈氏碘液于平板種，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液鋪滿整個(gè)平板。觀察能產(chǎn)生透明圈的菌落特征，進(jìn)行初步鑒定，并接種到牛肉膏斜面上保存。五、 技術(shù)路線 樣品采集富集培養(yǎng)（110r/min，37，24h） 倒平板（淀粉瓊脂培養(yǎng)基12個(gè)） 土壤稀釋液制備 涂布 培養(yǎng)（37，48h） 加碘液（觀察是否有淀粉水解圈產(chǎn)生