流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的合理設(shè)計與篩選.doc

流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的合理設(shè)計與篩選摘 要流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的上呼吸道疾病，每年影響數(shù)百萬人的健康，造成比較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會問題。但是到目前為止，人類對流感病毒一直缺乏安全有效的控制手段，這使得抗流感病毒藥物研究成為當(dāng)前藥學(xué)研究的一個熱點(diǎn)。隨著病毒學(xué)研究的進(jìn)展，對流感病毒復(fù)制和感染過程的機(jī)理研究取得了重大的突破，在此基礎(chǔ)上提出了一些可作為抗流感藥物研究的靶標(biāo)，比如：血凝素、神經(jīng)氨酸酶、基質(zhì)蛋白MZ以及核酸內(nèi)切酶等。本文以其中的一種靶標(biāo)化合物即神經(jīng)氨酸酶為研究對象，對其抑制劑做出合理的設(shè)計及篩選，為研究與合襯抗流感病毒的藥物提供一個較為合理的方向。關(guān)鍵詞：流感；流感病毒；神經(jīng)氨酸酶；定量構(gòu)效關(guān)系1、立項(xiàng)依據(jù)1.1、流感的危害以及防治現(xiàn)狀流行性感冒簡稱流感，是由流感病毒引起的呼吸道傳染病，具有傳染性強(qiáng)、流行面廣、發(fā)病率高等特點(diǎn)，在兒童、老人及高危人群中的死亡率很高。流感感染后的癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的心、腎等多種臟器衰竭并能導(dǎo)致死亡。流感可以通過消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結(jié)膜等多種途徑傳播，人員和車輛往來是傳播本病的重要因素。有數(shù)據(jù)表明，每次流感爆發(fā)期會使全球人口的近10%感染致病。僅在20世紀(jì)，流感的大流行就有三次，每次均使25%35%的人感染致病，死亡率超過2%。迄今為止，世界上已發(fā)生過五次流感的大流行和若干次小流行，造成數(shù)十億人發(fā)病，數(shù)千萬人死亡，嚴(yán)重影響了人們的生活和社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。而預(yù)防和治療流感給人們造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并導(dǎo)致勞動力的下降和人力資源的緊張。然而面對己對人類健康、社會經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重破壞的流行性感冒，人類卻一直缺乏有效的手段。1.2、有神經(jīng)氨酸酶抑制劑預(yù)防與治療流感的現(xiàn)狀NA抑制劑是目前探索抗流感化學(xué)治療藥物研究中取得的突破性進(jìn)展。它可以有效地阻斷流感病毒的復(fù)制過程。與其它類型的抗流感病毒藥物相比，NA抑制劑具有更高的療效及更好的安全性和耐受性，并對所有的流感病毒亞型均有效，也很少出現(xiàn)病毒的抗藥性。目前上市的NA抑制劑有兩種:葛蘭素公司得到Relenza羅氏公司的Tamiful，此外，還有一些神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物正在開發(fā)中，如BioCryst公司的BANA-113、BANA-206；Abbott公司的A-315675等。由此可見，由于神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物所具有的獨(dú)特機(jī)制及療效，它們己成為世界各大醫(yī)藥公司競相研究的熱點(diǎn)。1.3、立項(xiàng)意義作為一類新型的抗流感病毒藥物，NA抑制劑較金剛烷胺類藥物抗病毒譜更廣、耐藥率低且不良反應(yīng)少，顯示出較好的臨床療效早期治療不僅能減輕癥狀、縮短病程并促使患者迅速恢復(fù)，而且能夠減少流感的并發(fā)癥和相關(guān)抗生素的應(yīng)用。Oseltarivir對于流感的預(yù)防有確切的作用，尤其是在患者不能接種疫苗、對疫苗無反應(yīng)或接種疫苗無效時，其預(yù)防作用更為重要。綜上所述，流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑是繼金剛烷胺/金剛乙胺和病毒疫苗之后的一類具有全新作用機(jī)制的流感預(yù)防與治療藥物。它可同時抑制A型和B型流感病毒，不易引起抗藥性且耐受性好流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的開發(fā)成功是目前探索抗流感化學(xué)治療藥物研究中取得的突破性進(jìn)展。研究證實(shí)它能抑制流感病毒的復(fù)制，降低其致病性，可減輕癥狀、縮短病程、減少并發(fā)癥，并且毒性較低。可以預(yù)計隨著它在臨床上的推廣使用，將極大地減輕流感對人們健康的威脅。因此流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑作為一類新穎的抗流感病毒藥物將會具有更為廣闊的發(fā)展前景。2、項(xiàng)目研究內(nèi)容2.1、神經(jīng)氨酸酶抑制劑的設(shè)計思路2.1.1、 經(jīng)氨酸酶與底物作用機(jī)理1974年，Meindl等人發(fā)現(xiàn)NA催化反應(yīng)的過渡態(tài)類似物Neu5Ac2en可以等效地抑制病毒和非病毒的神經(jīng)氨酸酶的活性，因而推斷神經(jīng)氨酸酶的活性位點(diǎn)具有高度的結(jié)構(gòu)相似性。對神經(jīng)氨酸酶與-Neu5Ac復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，底物在結(jié)合時，可以由能量上占優(yōu)勢的椅式構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榕で拇綐?gòu)象，這種構(gòu)象的改變部分是由于底物的梭基與NA活性位點(diǎn)的三個精氨酸殘基形成鹽橋而導(dǎo)致的。同位素研究和分子模擬研究表明，NA對底物的催化作用主要是通過形成酶穩(wěn)定的唾液酸氧鎓離子中間體1。中間體1再與水分子發(fā)生立體選擇性反應(yīng)，優(yōu)先生成-Neu5Ac， -Neu5Ac再轉(zhuǎn)變?yōu)閯恿W(xué)更穩(wěn)定的異構(gòu)體-Neu5Ac。神經(jīng)氨酸酶的復(fù)合物共價鍵的形成是在Neu5Ac2en和NA高度保守的位于N-乙酰神經(jīng)氨酸C-2下方的酪氨酸殘基之間；另外，Neu5Ac2en及其結(jié)構(gòu)類似物對很多神經(jīng)氨酸有較好的抑制活性的事實(shí)也有力的支持了平面氧鎓離子過渡態(tài)的設(shè)想。2.1.2、 合物的合理設(shè)計實(shí)驗(yàn)表明2-氨基噻唑-4-乙酸乙醋和2-苯基-4-噻唑烷酸具有一定的NA抑制活性，其IC50分別為358umoL和21。3umoL，可以作為先導(dǎo)化合物對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。以這兩個化合物作為NA抑制劑設(shè)計、合成的先導(dǎo)化合物，結(jié)合計算機(jī)輔助藥物設(shè)計對齊進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以得到NA抑制活性增強(qiáng)的噻唑和噻唑烷類NA抑制劑，作為具有全新母核的NA抑制劑的研究開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。2.2、 感病毒神經(jīng)氨酸酶的生物活性評價通過大量的實(shí)驗(yàn)表明選擇流感病毒神經(jīng)氨酸酶作為抗流感病毒藥物的靶點(diǎn)，根據(jù)流感病毒神經(jīng)氨酸酶的三維結(jié)構(gòu)及與其活性位點(diǎn)作用的抑制劑的藥效團(tuán)模型，結(jié)合體外對神經(jīng)氨酸酶抑制劑活性的初步篩選，確定2-氨基噻唑-4-乙酸乙醋和2-苯基-4-噻唑烷酸作為先導(dǎo)化合物，并利用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計進(jìn)行合理藥物設(shè)計，對先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計、合成了噻唑類和噻唑烷類兩類新型的小分子流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑。所設(shè)計的這兩種化合物均具有一定的神經(jīng)氨酸酶一直記得活性，并且絕大多數(shù)的化合物對NA的抑制活性都比先導(dǎo)化合物有所增強(qiáng)；其中第一系列-噻唑類NAIs中活性最好的化合物為L4d，其活性比陽性對照弱20倍；而第二系列-噻唑烷類NAIs中活性最好的化合物為Y4f，其活性比陽性對照弱7倍。這些結(jié)果說明，噻唑和噻唑烷類都可以作為新型神經(jīng)氨酸酶抑制劑的全新母核，并且在以后研究中，可以使用發(fā)現(xiàn)的這些化合物作為抗流感病毒先導(dǎo)化合物，進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化，來發(fā)現(xiàn)活性更好的、可作為抗流感藥物開發(fā)的新型流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑。2.3、目標(biāo)化合物的構(gòu)效關(guān)系研究2.3.1、 比較分子場與定量構(gòu)效關(guān)系研究本研究通過COMFA方法來獲得流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的三維定量構(gòu)效關(guān)系，應(yīng)用Surflex-Dock對接方法與構(gòu)象系統(tǒng)搜索確定神經(jīng)氨酸酶抑制劑的可能活性構(gòu)象，并以此活性構(gòu)象為模板構(gòu)建小分子化合物的三維結(jié)構(gòu)，最后運(yùn)用COMFA方法對其進(jìn)行定量構(gòu)效關(guān)系研究。2.3.2、 板化合物的選擇及構(gòu)象確定確定抑制劑的活性構(gòu)象是COMFA模型建立的關(guān)鍵步驟，根據(jù)3D-QSAR的一般規(guī)律，具有手性碳原子的化合物應(yīng)分別用單一的光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行分子建模。本研究中，選擇產(chǎn)物中占據(jù)大部分的Yanti進(jìn)行分子建模。在設(shè)定的分子對接條件下，使用Surflex-Dock化合物Y4fanti與2HU4的活性中心進(jìn)行了對接選取對接構(gòu)象作為化合物的藥效構(gòu)象，并作為分子疊合的模板。進(jìn)行QSAR研究的化合物分子以此構(gòu)象為模板建立化合物庫，并進(jìn)行基于公共子結(jié)構(gòu)的分子疊合。2.3.3、 化合物的COMFA模建使用SYBYL軟件包中Edit/Build 模塊中sketch構(gòu)建了模板化合物Y4fanti，優(yōu)化過程中采用Powell能量梯度法，Tripos力場，迭代1000次，能量收斂限定為2。05Kcal/mol。A。定義Y4fanti中與R1、R2相連鍵作為可旋轉(zhuǎn)鍵，每次以15角遞增旋轉(zhuǎn)，選擇Compute energy check box為ON，設(shè)定其OFF的最大能量差異值為1000 Kcal/mol，其他值均為系統(tǒng)默認(rèn)值，對結(jié)果的能量值進(jìn)行Histogram分析，選擇能量分布最為集中的構(gòu)象，作為可能的藥效構(gòu)象模版分子Y4fanti。以Y4fanti作為模板，通過修飾相應(yīng)的原子或集團(tuán)分別構(gòu)建了其他化合物，并通過能量優(yōu)化得到三維結(jié)構(gòu)。2.4、 化合物的活性篩選本研究使用商品化的神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒，以有熒光特性的化合物為酶促反應(yīng)底物，建立了適合篩選小分子神經(jīng)氨酸酶抑制劑的熒光分析法。初步的體外神經(jīng)氨酸酶抑制活性測試結(jié)果表明，所合成的化合物均具有一定的神經(jīng)氨酸酶抑制活性，部分化合物活性達(dá)到林M級，雖然不及陽性對照oseltamivir，但可以作為先導(dǎo)化合物繼續(xù)進(jìn)行研究開發(fā)。3、總結(jié)與展望有效的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的研究主要基于以下幾個方面:對酶作用機(jī)理的了解;流感病毒神經(jīng)氨酸酶晶體結(jié)構(gòu)研究得到的信息以及組合化學(xué)等合理藥物設(shè)計技術(shù)的發(fā)展已有神經(jīng)氨酸酶抑制劑根據(jù)其結(jié)構(gòu)可以分為唾液酸類、苯甲酸類、環(huán)己烯類、呋喃類、環(huán)戊烷類、吡咯烷類、多聚體類及其他類。通過分子對接，探討了兩個系列化合物與神經(jīng)氨酸酶活性區(qū)域的作用模式;采用比較分子力場分析(COMFA)方法構(gòu)建了噻唑烷類化合物的定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型，結(jié)合模型給出的等勢線圖對其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了探討，所構(gòu)建的COMFA模型具有較好的交叉驗(yàn)證系數(shù)q2和預(yù)測能力，對于新型神經(jīng)氨酸酶抑制劑的研究與開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。而不足之處在于，所發(fā)現(xiàn)的噻唑烷類化合物是以一對非對映異構(gòu)體的形式存在，還沒有對其進(jìn)行分離，并且由于計算機(jī)模擬對接發(fā)現(xiàn)兩者的活性有所差別，若將這一對非對映異構(gòu)體分離，將可能發(fā)現(xiàn)活性比已測活性更好的化合物;另外，化合物的病毒活性測試也需完善。流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑是一類新穎的抗流感病毒藥物，是進(jìn)行合理藥物設(shè)計、取得成功的典型實(shí)例。流感病毒NA抑制劑對流感病毒的特性選擇性高、抑制活性好!細(xì)胞毒性小，在臨床研究中表現(xiàn)出療效顯著!患者耐受性好、不良反應(yīng)小，并不易出現(xiàn)抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，因此流感病毒NA抑制劑作為一類新穎的抗流感病毒將會具有更為廣闊的發(fā)展前景。參考文獻(xiàn)1 鄭培忠,沈建英.