不同基質(zhì)的中成藥及保健制品中鎮(zhèn)痛劑檢測方法的研究.doc

不同基質(zhì)的中成藥及保健制品中鎮(zhèn)痛劑檢測方法的研究項(xiàng)目完成單位：國家興奮劑及運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)測試研究中心項(xiàng)目完成人： 吳筠 申力 楊聲 朱紹堂 吳侔天 陸江海摘 要 采用酸水解、SEP-PAK C18小柱固體萃取、反提、脫水及衍生化等手段從復(fù)雜的基質(zhì)中分離蛋白質(zhì)、多糖、油脂、植物油等干擾組分，提取出有效的鎮(zhèn)痛藥成分，用GC/MSD法對鎮(zhèn)痛類藥物進(jìn)行定性和定量分析。本方法從糖、膏基質(zhì)液中的提取平均回收率： 77.7%;茶和淀粉劑基質(zhì)中的提取平均回收率: 80.1%;蛋白粉中的提取平均回收率:78.5%;油類中的提取平均回收率72.5%;酒類中的提取平均回收率:77.2%,結(jié)果表明該方法提取率高,準(zhǔn)確、靈敏、可靠。1 引言 隨著科技的迅速發(fā)展和人民生活水平不斷地提高.怎樣增強(qiáng)免疫能力、強(qiáng)身健體、消除疼痛、疲勞和提高運(yùn)動(dòng)能力等已經(jīng)成為公眾關(guān)注的問題。近年來不斷有種類繁多的不同基質(zhì)的鎮(zhèn)痛保健制品推出。許多運(yùn)動(dòng)員也都在使用這些產(chǎn)品。經(jīng)過檢測研究，發(fā)現(xiàn)部分產(chǎn)品為了追求明顯的效果在產(chǎn)品中引進(jìn)某些動(dòng)植物藥成份。這是我國衛(wèi)生部對于保健制品嚴(yán)令禁止的，并且也不符合國際奧委會(huì)的規(guī)定。開展這方面的研究,建立相應(yīng)的檢測方法，這對于保護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益和身體健康，尤其是少年兒童的身體健康，確保運(yùn)動(dòng)員在獲得良好的治療效果并提高運(yùn)動(dòng)能力的同時(shí)不出興奮劑問題，維護(hù)我國運(yùn)動(dòng)員在體壇特別是國際體壇的聲譽(yù)，有著十分重要的意義。目前，由于許多鎮(zhèn)痛的中成藥、保健制品都是一些含有糖、油脂、蛋白、動(dòng)植物成分和軟膏劑基質(zhì)的產(chǎn)品，用現(xiàn)有的尿樣的分析方法難以有效分離，提取和回收率低。本課題在已有的研究基礎(chǔ)上，用酸水解、SEP-PAK C18小柱固體萃取、反提、脫水等手段從復(fù)雜的基質(zhì)中分離蛋白質(zhì)、多糖、油脂、植物油等干擾組分，提取出有效的鎮(zhèn)痛藥成分，用GC/MSD法對此類藥物進(jìn)行定性和定量分析。本方法已成功地用于2004年雅典奧運(yùn)會(huì)運(yùn)動(dòng)員服用運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品的檢測。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 儀器： Agilent 5973N-6890 GC/MSD, 質(zhì)量選擇檢測器，掃描范圍：50650。分析柱為HP-5 MS固定相為交聯(lián)甲基聚苯硅醚，長25m、內(nèi)徑0.2mm，膜厚0.33mm；C18固體柱（Water 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA)；電熱鼓風(fēng)干燥箱CS101-AB；三和松石混勻器；循環(huán)水式多用真空泵SHB-3。2.2 試劑： 甲醇、乙醚、正己烷、異丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯，碳酸氫鈉，碳酸鉀，氫氧化鈉都是北京化學(xué)試劑公司的產(chǎn)品，以上都是分析純試劑。半胱氨酸，MSTFA，MBTFA均是Sigma產(chǎn)品。混合標(biāo)品液:準(zhǔn)確量取濃度為1 mg/ml的鎮(zhèn)痛新(pentazocine PE)、可卡因(cocaine CA)、美散痛(methadone ME)、嗎啡(morphine MO)、哌替啶(petidine PT)、可待因(codeine CD)、雙氫可待因(dihydrocodeine DH)、乙基嗎啡(ethylmorphine EM)、安儂痛(anadol AD)各10g,溶入5ml甲醇中。2.3 樣品制備：取50l混合標(biāo)品液，放入10ml螺口試管中，在60C氮?dú)庀麓蹈?，加入基質(zhì)，加水配成5ml溶液1。2.4 儀器條件：載氣:高純氦氣,流速為0.9mL/min(溫度為180C時(shí))，分流進(jìn)樣，分流比為1:10，進(jìn)樣口溫度250C，接口溫度290C，離子源溫度230C，電子能量70eV，升溫程序:180C，以10C/min升至220C，又以5C/min升至260C，再以10C/min升至280C，保留10分鐘。2.5 樣品提?。?）含糖、膏基質(zhì)液:取上述溶液1，加入1.2g口服液或含糖顆粒沖劑基質(zhì)，加0.6 ml 12 mol/L氫氧化鈉溶液, 2g碳酸氫鈉:碳酸鉀(3:2 W/W)的固體緩沖劑2，混勻,調(diào)pH=10左右,用3mL 乙酸乙酯：異丙醇（9：1 V/V）3提取兩次，合并后濃縮至干后，用4ml 5% 醋酸溶解，用1g固體緩沖劑1，調(diào)pH=10左右，用4 mL三氯甲烷反提，加入無水硫酸鈉干燥，將有機(jī)層移至磨口錐形試管中，在650C氮?dú)庀麓蹈伞?）茶和淀粉劑基質(zhì)：取上述溶液1數(shù)份，分別加入0.2g上述基質(zhì)，加入2g固體緩沖劑2，調(diào)pH=9.6左右，再加入3mL提取液3，振蕩10分鐘，離心5分鐘。冷凍分層后棄去水相，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至10mL離心管中。在650C氮?dú)庀麓蹈伞?）補(bǔ)酒基質(zhì)：取上述溶液1，加入0.9g補(bǔ)酒，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸去乙醇，再按樣品提取1提取。4）蛋白粉基質(zhì)：取上述溶液1，加至SEP-PAK C18小柱固體萃取，分別用5mL甲醇和水洗脫，洗脫液加100mg半胱氨酸，再加入0.5mL濃鹽酸，在100C下水解30分鐘，冷至室溫。加3mL乙醚洗，棄去有機(jī)相，向水相中加入0.6mL 12 mol/L氫氧化鈉，混勻。加入2g固體緩沖劑2，混勻。再加入3mL提取液3，振蕩10分鐘，離心5分鐘。冷凍分層后棄去水相，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至10mL離心管中,氮?dú)饬飨麓蹈伞?）油狀基質(zhì)：取上述溶液，加100mg半胱氨酸，再加入0.5mL濃鹽酸，在100C下水解30分鐘，冷至室溫。加3mL乙醚洗，再用3mL正己烷洗，棄去有機(jī)相，向水相中加入0.6mL 12 mol/L氫氧化鈉，混勻。加入2g固體緩沖劑2，再加入3mL提取液3，振蕩10分鐘，離心5分鐘。冷凍分層后棄去水相，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至10mL離心管中,氮?dú)饬飨麓蹈伞?.6 衍生化： 在殘?jiān)屑尤隡STFA 100mL，振蕩，在70C下反應(yīng)10分鐘。加入MBTFA 30mL，在70C下反應(yīng)10分鐘。轉(zhuǎn)移至衍生化小瓶中，進(jìn)2mL于GC/MSD。3 結(jié)果與討論方法的回收率: 1）對照樣品的制備：準(zhǔn)確量取濃度為1 mg/ml的 PE、CA、 methadone、 MO、PT、CD、DH、 EM、AD各10g兩份,吹干，各加入5mL空白尿，加入2g固體緩沖劑2，再加入3mL提取液3，振蕩10分鐘，離心5分鐘。冷凍分層后棄去水相，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至10mL離心管中。2）同時(shí)取5個(gè)兩份空白尿按不同的5種方法提取后,有機(jī)相中分別加入0.5mL對照樣品,吹干,衍生化(1,2); 3）在5份兩個(gè)試管中分別加對照樣品0.5mL, 氮?dú)饬飨麓蹈?。各加?種不同基質(zhì)的物質(zhì)5mL，按不同的5種方法提取后, 吹干,衍生化。（編號為3，4-含糖、膏基質(zhì)液；5，6-茶和淀粉劑基質(zhì)；7，8-補(bǔ)酒基質(zhì)；9，10-蛋白粉基質(zhì)；11，12-蛋白粉基質(zhì)）。用每個(gè)物質(zhì)的特征離子為定性離子，用3、4的平均峰面積/1、2的平均峰面積，5、6平均峰面積/1、2的平均峰面積,5，6平均峰面積/1、2的平均峰面積,， 7、8平均峰面積/1、2的平均峰面積，9、10平均峰面積/1、2的平均峰面積，11、12平均峰面積/1、2的平均峰面積，結(jié)果見表1. 表1NameADCACDDHEMMEMOPEPTM/z172823713733857242928971Extra170.2 %82.6 %68.6 %69.1 %71.4 %91.6 %73.1 %89.6 %82.7 %Extra273.2 %84.3 %76.1 %76.5 %74.3 %89.6 %80.1 %86.7 %80.4 %Extra370.3 %80.7 %72.9 %73.8 %70.9 %80.6 %76.6 %78.6 %79.8 %Extra480.3 %86.7 %82 %78.9 %76.3 %88.4 %70.8 %72.6 %70.4 % Extra