實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的配制與滅菌技術(shù).docx

實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的配制與滅菌技術(shù)一、目的要求1 掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2 學(xué)習(xí)高壓滅菌鍋的操作方法。二、基本原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏為微生物提供碳源和能源，磷酸鹽、蛋白胨主要提供氮源，而NACL提供無機(jī)鹽。在配制固體培養(yǎng)基時(shí)還要加入一定量瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下96時(shí)溶化，一般實(shí)際應(yīng)用時(shí)在下面墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40時(shí)凝固，通常不被微生物分解利用。由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細(xì)菌，因此，要用稀酸或稀堿將其pH調(diào)至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長繁殖。高氏1號(hào)培養(yǎng)基是分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基，是由可溶性淀粉作碳源，KNO3作氮源，NaCl，K2HPO4.3H2O，MgSO4.7H2O，F(xiàn)eSO4.7H2O為微生物提供鈉、鉀、磷、鎂、硫等離子。高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100的溫度，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固；二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。滅菌的溫度及維持的時(shí)間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。通常為15磅/英寸2 (121.3)滅菌1520分鐘；不耐高壓的培養(yǎng)基則可采用流通蒸汽滅菌或間歇滅菌。含糖培養(yǎng)基用112.6（8磅/英寸2）滅菌15分鐘。紫外線滅菌是用紫外線燈進(jìn)行的，紫外線殺菌機(jī)制主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成，從而抑制了DNA的復(fù)制；由于輻射能使空氣中的氧電離成O再使O2氧化生成臭氧O3或使水H2O氧化生成過氧化氫H2O2，O3和H2O2均有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以，只適用于無菌室、接種箱的空氣及物體表面的滅菌。三、器材天平，高壓蒸汽滅菌鍋，電烘箱，1mol/L NaOH,1mol/L HCl，培養(yǎng)皿，試管，吸管，酒精燈，三角燒瓶，燒杯，量筒，玻棒，接種環(huán)，牛角匙，pH試紙(pH5.59.0)，棉花，紗布，牛皮紙，記號(hào)筆，麻繩。四、操作步驟1 稱量培養(yǎng)基的配方見附錄。2 溶化（1） 在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。（2） 配制高氏1號(hào)培養(yǎng)基時(shí)，用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化，再稱取其他各成分依次逐一溶化，對(duì)微量成分FeSO4.7H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在100ml水中加入1g的FeSO4.7H2O配成0.01g/ml，再在1000ml培養(yǎng)基中加入1ml的0.01g/ml的貯備液即可。（3） 將馬鈴薯塊放入少于所需水量的水中，在石棉網(wǎng)上加熱，攪拌以免馬鈴薯塊糊在燒杯底，煮沸20分鐘，經(jīng)常補(bǔ)充水分，將馬鈴薯及煮沸液經(jīng)4層紗布過濾，補(bǔ)充水分到所需體積，加入稱量的糖。3 調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測其pH值，直至pH達(dá)7.6。反之，則用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)，否則，將會(huì)影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。對(duì)于有些要求pH值較精確的微生物，其PH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行。4.分裝按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)（見圖1）。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面；分裝三角瓶的量以不超過容積達(dá)一半為宜。5.加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。應(yīng)使棉塞長度的1/3在試管口外，2/3在試管口內(nèi)。4 生理鹽水的配置分裝 用吸管量取相應(yīng)體積的生理鹽水。圖1 分裝 7. 包扎加塞后，將全部試管用橡皮筋捆扎好，再在棉塞外保一層牛皮紙或報(bào)紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕棉塞，其外再用橡皮筋扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱，日期。8. 滅菌（1） 首先將內(nèi)層滅菌筒取出，再向外層鍋加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。（2） 放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞，（3） 加蓋，將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓。（4） 通電加熱，并同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。（5） 滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時(shí)，打開排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。9. 擱置斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50左右，將試管棉塞端擱在木條上（見圖2）。10. 倒平板將培養(yǎng)基溶化，待冷至5560時(shí)，將幾種培養(yǎng)基分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿。手持法（見圖5）：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶，置火焰旁，左手拿平皿并松動(dòng)試管塞或瓶塞，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出。如果試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基一次可用完，則管塞或瓶塞不必夾在手指中。瓶口在火焰上滅菌，左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即可成平板。皿架法（見圖4）：將平皿疊放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夾住管塞并打開培養(yǎng)皿，再注入培養(yǎng)基，搖均后制成平板。11.無菌試驗(yàn)將已滅菌的培養(yǎng)基，置無菌試管內(nèi)，放在37孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)，將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37溫箱培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.如何檢驗(yàn)滅菌后培養(yǎng)基是否合格？2.高壓蒸氣滅菌開始之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么要待降到0時(shí)才能打開排氣閥，開蓋取物？附錄 培養(yǎng)基的配置一、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌用）牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 瓊脂 1520g 水 1000ml pH 7.4-7.6配置時(shí)，按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加熱，牛肉膏便會(huì)與稱量紙分離，然后立即取出紙片。蛋白胨很易吸潮，在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。牛角匙稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品。將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最后補(bǔ)足所失的水分。二、高氏1號(hào)培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用）可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO3 1g K2HPO4.3H2O 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g 瓊脂 1520g 水 1000mlpH 7.4-7.6配置時(shí)，淀粉單獨(dú)稱量在50ml小燒杯中。三、馬鈴薯培養(yǎng)基（培養(yǎng)真菌用）馬鈴薯 200g 蔗糖 20g瓊脂 1520g 水 1000mlpH 自然 配置時(shí)，馬鈴薯去皮，切成小塊，稱量。實(shí)驗(yàn)二 土壤微生物的分離一、目的要求1 學(xué)習(xí)無菌操作技術(shù)2 掌握幾種分離純化微生物的基本方法二、基本原理 在土壤、水、空氣或人及動(dòng)、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時(shí)，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。一般根據(jù)該微生物對(duì)營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求的不同，供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。土壤是我們開發(fā)利用微生物資源的重要基地，可以從其中分離、純化到許多有用的菌株。三、器材肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基，馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，10酚，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環(huán)，無菌培養(yǎng)皿，鏈霉素，菜園土，玻片，酒精燈，革蘭氏染液。四、操作步驟（1） 制備土壤稀釋液稱取土樣10g，放入盛90ml生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩約20分鐘，將菌分散。用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液注入盛有9ml無菌水的試管中，吹吸三次，使充分混勻。然后再用一只無菌吸管從此試管中吸取1ml注入另一裝有9ml無菌水的試管中，以此類推，制成101，102，103，104，105，106稀釋度的土壤溶液。（2） 涂布或劃線（a） 將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號(hào)筆寫上104，105，106三種稀釋度，然后用三支1ml無菌吸管分別由104，105，106三管土壤稀釋液中各吸取0.2ml對(duì)號(hào)放入寫好稀釋度的平板中，用無菌玻璃推子在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻（見圖1）。（b） 用接種環(huán)以無菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線 34條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)基約70。角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后將接種環(huán)搭在平行線上作第二次平行劃線，同樣作第四次劃平行線，劃線結(jié)束后，蓋上皿蓋（見圖2）。（3） 培養(yǎng) 將涂布或劃線后的培養(yǎng)基平板倒置于不同溫度的溫箱中培養(yǎng)并觀察生長情況。（4） 挑菌將培養(yǎng)后長出的單個(gè)菌落，挑取接種到斜面上，分別置28和37溫箱中培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查菌苔，顯微鏡涂片觀察判斷是否是單一的微生物，若有其他雜菌，再一次進(jìn)行分離純化。（5） 鑒定對(duì)分離得到的細(xì)菌的進(jìn)行生理生化反應(yīng)測定。參考相關(guān)微生物鑒定手冊。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、在選擇培養(yǎng)基上是否分離到細(xì)菌？根據(jù)在1，101，102三種稀釋度平板上分離得到的單菌落，確定最佳稀釋濃度。2、在平板劃線法中，為什么每次都需將接種環(huán)上的剩余物燒掉？3、為什么要將培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)？附:一、絲狀真菌（霉菌）的分離純化（1）分離源: 菜園土（2）培養(yǎng)基 馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯 200g 蔗糖 20g 瓊脂 15-20g 水 1000ml 馬丁培養(yǎng)基：蛋白胨 5g MgSO47H2O 0.5g葡萄糖 10g KH2PO4 1.0g瓊脂 18-20g H2O 1000ml 加入孟加拉紅水溶液3.3ml，121，20min滅菌。使用前，每100 ml培養(yǎng)基加入1%鏈霉素溶液0.3 ml。 查氏培養(yǎng)基：蔗糖 30g FeSO4 0.01gNaNO3 2.0g MgSO47H2O 0.5gK2HPO4 1.0g H2O 1000mlpH值 自然 115， 滅菌20min（3）方法將分離用的樣品，用無菌水制成一系列10倍稀釋懸液。根據(jù)樣品來源選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基。分離土壤樣品較多采用馬丁瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；霉變材料及河塘泥、生物膜等樣品中霉菌的分離多采用查氏瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、或馬丁氏瓊脂等。用無菌吸管分別吸取0.5 - 1ml不同稀釋度的菌懸液，接入無菌平板，按常規(guī)的混菌法或涂布法進(jìn)行分離操作。每個(gè)稀釋度一般做三個(gè)平皿。置于2328培養(yǎng)37天，待菌落長好作進(jìn)一步分離純化。依據(jù)菌落形態(tài)、質(zhì)地和正反面顏色，判斷是否為純培養(yǎng)物。如有細(xì)菌或其他雜菌污染，則可挑取霉菌孢子或菌絲，用平板劃線法重復(fù)分離純化。對(duì)于形成固定菌落的如青霉、曲霉等，可用稀釋平板混菌法分離純化。菌落不定形、蔓延繁殖的如根霉、 毛霉等，因兩個(gè)菌落極易接觸混雜，故分離時(shí)需采用較高的稀釋度或以培養(yǎng)1624小時(shí)生長的菌絲接種。二、放線菌的分離純化（1）分離源: 菜園土（2）培養(yǎng)基：高氏1號(hào)培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用）可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO3 1g K2HPO4.3H2O 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g 瓊脂 1520g 水 1000mlpH 7.47.6三、酵母菌的分離純化（1）分離源：果園土，水果表皮，腐爛水果，酸牛奶（2）培養(yǎng)基：乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯 200g 乳酸 5ml葡萄糖 20g 水 1000ml馬鈴薯去皮，切塊，取200g,加水煮沸30min, 紗布過濾，補(bǔ)足水至1000ml，加入其他成分即可，條件為115，20min,pH自然。（3）富集培養(yǎng)將待分離樣品放入盛有無菌水與玻璃珠的三角瓶中，使樣品振蕩分散后取上清液，接種于乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，2528培養(yǎng)37天，培養(yǎng)液變混濁，產(chǎn)生菌膜或沉淀物，取富集液，經(jīng)適當(dāng)稀釋，吸取0.2ml接入乳酸馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，用涂布器涂布，正放于2528，培養(yǎng)24h，表面水分吸干后再倒置培養(yǎng)。四、纖維素分解菌的分離純化（1） 分離源 草地表層土壤、堆腐爛植物體、湖水等。（2） 培養(yǎng)基： 蛋白胨 10g 酵母粉 10g 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 10g NaCl