生物工程專業(yè)英語第三章翻譯36-37.doc

3.6分析和操縱遺傳物質(zhì)已革命性的發(fā)展在體外基因的克隆技術(shù)，允許隔離，凈化和選擇性擴增在適當?shù)纳锵到y(tǒng)幾乎任何離散段從幾乎任何生物體。由于刪除基因不含相關(guān)基因，基因的克隆可以采用的方法分析和處理是主要針對基因區(qū)域的利益，從而大大提高效率的方法，簡化了識別和表征（特征分析）的新型改性衍生物。相反，原生質(zhì)體融合，大部分或全部基因組混合的特點和興趣控制一般由大量的基因（例如，抗生素），基因重組技術(shù)主要關(guān)注的是少數(shù)個別基因的已知基因的產(chǎn)品（例如，保護蛋白質(zhì)，多肽等。）。該l978遺傳操作規(guī)定（基因操作條例）定義的遺傳操縱的形成新的組合的遺傳物質(zhì)的分離的核酸分子，通過任何手段以外的細胞，任何病毒，細菌質(zhì)粒，或其他載體系統(tǒng)，使其納入（摻入）宿主生物體中，他們不自然地出現(xiàn)在他們能夠繼續(xù)繁殖的遺傳操縱。因此定義不包括，例如，單克隆抗體，改良微生物常規(guī)遺傳技術(shù)，體外受精或克隆技術(shù)用于動物使用。遺傳操作技術(shù)，到目前為止，只有一小的貢獻，雖然重要的，生物技術(shù)的研究和應用。在過去十年中幾個重要的發(fā)現(xiàn)是在介于分子生物學的迅速發(fā)展引發(fā)了基因重組技術(shù)。特別意義的孤立的突變株大腸桿菌不能分解或限制外源基因?qū)爰毎?，并確定和表征限制性內(nèi)切酶能夠切割雙鏈（德尚）基因在特定的網(wǎng)站。一般來說，這樣的片段無法改造或復制有效地在宿主細胞。這一問題已在很大程度上克服了插入片段為載體，可以插入到宿主細胞，使有關(guān)信息表達的載體。通常是細菌質(zhì)粒，噬菌體或酵母2DNA，共價粘接的片段的載體，是實現(xiàn)與酶核酸連接酶。新合成的載體或嵌合分子進行改造宿主生物，如大腸桿菌，枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和宿主細胞生長和繁殖（克?。┮矊⑤d體復制和擴增基因。它可以克隆整個基因組，從而創(chuàng)造一個大規(guī)模的收集或圖書館（庫）獨立分子（基因組文庫基因組文庫。）將包含所有的生物基因組序列，原則上應是可能的孤立任何基因提供一個具體的探針檢測可以得到。如果平均大小的克隆序列20個堿基，約700000個人克隆將需要一個完整的圖書的人類基因組。遺傳操作技術(shù)提供了革命性的能力，因為它們是快速，普遍適用的，允許一個高度控制在操作過程中，首先產(chǎn)生形成新的基因組合，之前從未被選定的實驗室方法?；蛑亟M技術(shù)已成為發(fā)展最快的方面的生物科學。中央對這一新技術(shù)的概念是克隆已確定由蒂米斯（1981）的分離和個體傳播的一個單一的元素能夠繁殖的混合物相似的元素。在實踐中，克隆一直被用來傳播純培養(yǎng)的病毒，微生物和植物的營養(yǎng)方式從而保證精確的生物體的基因組（表3.2。）。如今，該詞還包括分離和維護個人自治遺傳因素如質(zhì)粒和潛隱病毒的基因組?？寺〖毎袡C體只需要營養(yǎng)介質(zhì)；克隆的病毒和質(zhì)粒將涉及一個特定的宿主細胞結(jié)合營養(yǎng)培養(yǎng)基，而克隆的基因?qū)⑿枰d體的復制，一個特定的宿主細胞和營養(yǎng)培養(yǎng)基。所有類型的克隆具有重要的作用，生物技術(shù)；因此所有的微生物，植物和動物細胞可用于生物技術(shù)的進程需要保持和傳播在純和恒定狀態(tài)，而病毒和質(zhì)粒傳播或放大，特別是，已確定為功能強大的工具，在新的生物技術(shù)。 原則的基因克隆或基因重組技術(shù)將簡要討論使用的主要例子的大腸桿菌K - 12質(zhì)粒載體系統(tǒng)。雖然基因克隆技術(shù)的使用病毒載體在不同的細節(jié)，參與的原則是相似的?；疽篌w外轉(zhuǎn)染和表達外源基因在宿主細胞中概述圖3.6和圖3.7和可歸納如下：（1） 孤立的質(zhì)粒脫氧核糖核酸分子，必須包含一個網(wǎng)站，整合外源基因不會破壞基本功能。（2）新一代的基因片段，克隆的方式適用于限制性內(nèi)切酶。可插入一個染色體片段從另一個微生物（原核生物或真核生物），從動物或植物，或從化學合成的脫氧核糖核酸序列。（3）拼接的方法，外源基因的載體。（4）納入混合基因重組進入宿主細胞。（5）表達的轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化子），重組質(zhì)粒。因此，一個主要特點，這種新的遺傳技術(shù)，它允許相當大的控制權(quán)的片段被克隆和可以使用基本的任何片段從任何生物體。質(zhì)粒?；镜倪@一新技術(shù)的質(zhì)粒。質(zhì)?？梢苑€(wěn)定遺傳的基本分子沒有被鏈接到染色體。它們是重要的醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)因為他們賦予抗生素耐藥性的病原體的人和動物，可以規(guī)范毒素和其他蛋白可能增加毒力的這種病原體。他們也很重要，因為有些可能參與固氮根瘤菌屬。而其他人可以代碼為范圍廣泛的代謝活動，使某些細菌降解化合物可能成為環(huán)境污染物，質(zhì)粒分子雙鏈脫氧核糖核酸存在的共價閉合環(huán)狀分子（中心）的宿主細胞。分子量質(zhì)粒的范圍從1106至200106。接合質(zhì)?？梢宰晕覐椭频搅硪粋€從一個細菌可以通過件染色體細菌插入序列和轉(zhuǎn)座子。也可以攜帶質(zhì)粒。質(zhì)?？梢杂脕碜鳛檩d體，克隆基因。質(zhì)粒攜帶耐藥基因被稱為電阻（R）質(zhì)粒和一定的大腸桿菌耐藥質(zhì)粒已被用來作為載體。一個最最常用的質(zhì)粒克隆大腸桿菌基因是pBR322賦予抗氨芐青霉素和四環(huán)素。質(zhì)粒脫氧核糖核酸可以被孤立的溶藻細菌細胞分離質(zhì)粒染色體脫氧核糖核酸在氯化銫梯度含有溴化。一些較小的質(zhì)粒等關(guān)口電致發(fā)光是維持在高拷貝數(shù)在宿主細胞，因此可以合成大量質(zhì)粒編碼的產(chǎn)品，因為每個細菌載有多個拷貝的基因的興趣。當細胞治療氯霉素（氯霉素改編），其中有選擇性地抑制染色體的復制，有進一步的實質(zhì)性的選擇性擴增質(zhì)粒脫氧核糖核酸。對pBR 322質(zhì)粒包含復制因素的關(guān)口E1-related質(zhì)粒pMB1，氨芐青霉素抗性基因質(zhì)粒受體1（TN3）和四環(huán)素耐藥基因的質(zhì)粒pSC 101作為選擇標記。它包含單一卵裂網(wǎng)站至少十種內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶。微生物能夠區(qū)分自己的脫氧核糖核酸，這是從其他來源。該系統(tǒng)已發(fā)展到實現(xiàn)區(qū)分自我和非自治領(lǐng)土依賴于類型的酶在細胞：改性甲基化酶和限制性內(nèi)切酶。該甲基化酶添加甲基組在一個特定的方式各種核苷酸殘基的新生的雙鏈脫氧核糖核酸鏈。這樣的識別序列通常是從四到七堿基對的長度，回文，即，在一個鏈序列的雙鏈DNA是相同的互補鏈。大多數(shù)生物體擁有一些不同的改性甲基化酶。限制性內(nèi)切酶識別相同的序列作為修飾酶，而甲基化，減少脫氧核糖核酸序列的核酸內(nèi)切酶。然而，不會削減自我序列，但會降低外國的脫氧核糖核酸。此屬性的識別和切割的特定序列的雙鏈核酸已成為基礎切除片段從大多數(shù)類型的生物體。不同類型的限制性內(nèi)切酶發(fā)生，即類型，和。只有型是重要的新技術(shù)。型限制性內(nèi)切酶有特殊重要性因為他們是序列特異性，可以創(chuàng)建雙鏈斷裂位置準確的雙鏈脫氧核糖核酸。這樣他們打破長期外源基因分子成較小的部分以及一個打破質(zhì)粒載體在網(wǎng)站上的片段可以插入一些這些酶。斷裂，產(chǎn)生單鏈末端和堿基序列這些總站將是相同的所有碎片產(chǎn)生的一個特定的限制核酸。這種方式在任何片段所產(chǎn)生的具體內(nèi)切酶可以與任何其他片段的堿基對的切割相同內(nèi)切酶和退火，從而創(chuàng)造一個混合分子。由于許多限制性內(nèi)切酶現(xiàn)已從細菌范圍標準術(shù)語已被采納。屬和種的名字的宿主生物體被確定的第一個字母的屬和第一個字母的物種形成的一三字母縮寫斜體，e.g.e.coli，生態(tài)。應變或類型識別是在非斜體的符號（限制性）和數(shù)量的內(nèi)切酶酶切羅馬數(shù)字。不同的酶可用于產(chǎn)生不同大小的基因具有不同的3 -或5-四單鏈延伸?；蚓涂梢约兓娪?。水解單靶位點的限制性pBR 322，或任何限制性內(nèi)切酶有一個單一的目標網(wǎng)站，轉(zhuǎn)換為線性質(zhì)粒脫氧核糖核酸分子。網(wǎng)站所承認的最型限制性內(nèi)切酶有2倍對稱軸：他們可以是四，五或六核苷酸序列。酶裂解基因可以創(chuàng)建鈍端或粘性，粘性末端的其中幾個未配對的堿基終止在3 -羥基或5-磷酸組織工程的目的。許多最有用的限制性內(nèi)切酶識別四或六核苷酸重復的網(wǎng)站。因此，后酶克里弗斯在中間的一六個堿基對的序列fig.3.8g（a）會導致形成的鈍結(jié)束的脫氧核糖核酸分子，才能加入低效率脫氧核糖核酸連接酶。限制性克里弗斯承認網(wǎng)站遠離中心fig.3.8（b），因為回文性質(zhì)的酶識別位點的原因形成雙鏈脫氧核糖核酸片段的單鏈末端或粘?；旌衔飼r，這些碎片是混合氫鍵之間發(fā)生堿基互補的單鏈序列和目的成為。一個特定的序列序列應該發(fā)生在平均每4096（46）個堿基對。所產(chǎn)生的碎片一個內(nèi)切酶識別四核苷酸序列會的平均長度為256堿基對的：注意，樣品的數(shù)量要求代碼為一個典型的蛋白分子質(zhì)量約為1000個核苷酸長35000?；蚱蔚目寺∫部赡塬@得比其他使用限制性內(nèi)切酶：這些包括機械剪切，超聲波，化學合成，或通過使用酶逆轉(zhuǎn)錄合成的復制基因（三脫氧核糖核酸）從真核細胞信使核糖核酸模板。這最后一種方法克服的問題，內(nèi)含子或干預序列的特點是大多數(shù)基因在高等真核生物。這些內(nèi)含子無法刪除在轉(zhuǎn)錄的基因在細菌而在真核表達他們被刪除的剪接初級轉(zhuǎn)錄（轉(zhuǎn)錄本）的基因。加入載體。 插入并連接到載體的基因片段可以通過多種方法。治療混合物脫氧核糖核酸片段的大腸桿菌或噬菌體脫氧核糖核酸連接酶將產(chǎn)生共價鍵之間的聯(lián)系的克隆載體和核酸分子，共價磷酸二酯鍵之間將形成碎片有退火對方的粘性末端。一個更有效結(jié)扎的方法的鈍端”或“平端結(jié)扎fig.3.8（a）。在這種情況下的脫氧核糖核酸分子沒有預測（突出）單鏈脫氧核糖核酸和脫氧核糖核酸末端需要高濃度的酶和有效結(jié)扎。然而，此方法允許的范圍更廣內(nèi)切酶用于增加了一系列的基因進行研究，當這種混合形成了它不能被切割的任何的內(nèi)切酶，被用來生成原始片段。這種潛在的缺點是可以克服使用連接，即短期合成多核苷酸包含一個或多個內(nèi)切酶識別序列。許多連接現(xiàn)已允許容易修改基因片段的總站。使用連接序列允許鈍端結(jié)扎的連接到脫氧核糖核酸片段之后卵裂的連接合適的內(nèi)切酶的形成具體的總站必要fig.3.8（丙）。這樣的克隆片段容易被再液化從重組質(zhì)粒消化正確的內(nèi)切酶。一個更少的使用方法包括增加一個尾幾個脫氧鳥苷殘留的3 -端的矢量和脫氧胞嘧啶核苷酸殘留的3 -端插入形成互補的單鏈擴展插入和載體。連鎖發(fā)生的堿基互補配對。新產(chǎn)品p1us質(zhì)粒插入片段稱為質(zhì)粒嵌合體。轉(zhuǎn)型。技術(shù)引進基因注入細菌長期以來一直贊賞和可能涉及的染色體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時發(fā)生。噬菌體是參與。在一個典型的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實驗將有一個極其異構(gòu)混合物分子中只有一小部分組成一個單一的載體分子連接到一個單一的基因片段在大腸桿菌。用于轉(zhuǎn)化的分子混合細菌細胞已取得主管（感受態(tài)）或滲透通過暴露于冷氯化鈣溶液（0.1M）。細胞然后加熱到37保持5分鐘讓基因被占用。細胞轉(zhuǎn)移到肉湯和后短潛伏期（孵育）期間能夠表達的功能，新獲得的嵌合基因的細菌進行雜交分子。通過一個具體的篩選程序和純化：雜交質(zhì)粒孤立和特點，或新產(chǎn)品的分離和研究。轉(zhuǎn)換效率約106克得到一微克轉(zhuǎn)化克隆混合物脫氧核糖核酸。質(zhì)粒載體正在開發(fā)的其他細菌，噬菌體載體和粘粒（其中包括一個正常的質(zhì)粒含有粘性末端噬菌體）也可以被用來。革蘭陰性菌，特別是大腸桿菌，已廣泛用于基因重組工作。特殊載體已經(jīng)發(fā)展為革蘭氏陽性菌，尤其對枯草芽孢桿菌和霉菌菌株。廣泛研究的進展將這個新的基因工程技術(shù)對真核系統(tǒng)，酵母是強有力的候選人，作為東道主的真核細胞克隆和雙質(zhì)粒用2核酸酵母和pBR 322質(zhì)粒的大腸桿菌已成功地開發(fā)和使用。克隆動物細胞可以實現(xiàn)使用基因組的特種動物病毒，例如，猴病毒sv40.1n植物細胞克隆是不完善；鈦質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌證明是有用的。高等植物基因重組技術(shù)已被視為越來越重要的育種潛力，允許直接遺傳修飾植物來提高生產(chǎn)力。功能表達的新基因在轉(zhuǎn)基因植物尚未得到報告。一個主要原因是有限的了解的分子基礎的基因在植物中表達的基因。此外，最重要的植物特點尚未確定。而人口的工程細胞是有用的產(chǎn)品微生物基因工程，細胞工程項目中是很少價值，如果他們不能再生到整個工廠。不幸的是，相對較少的重要農(nóng)藝作物還可以再生從細胞培養(yǎng)。潛在的改善作物遺傳是通過無疑巨大而更基本的研究需要在幾乎所有地區(qū)的植物分子生物學戈瑞才能實現(xiàn)。鑒定轉(zhuǎn)化。 在大多數(shù)克隆實驗的主要部分的方案將涉及鑒定轉(zhuǎn)化重組克隆。正常數(shù)量的基因改造納入受援國主機將非常遠小于宿主染色體，所以產(chǎn)品標識表示從轉(zhuǎn)化片段將極其困難，然而，有多種方法為了確定克隆攜帶所需的脫氧核糖核酸序列。（1） 互補一些外來基因能夠補充缺陷的副本相同的基因在染色體上的：即，他們代碼正常，活躍產(chǎn)品，收件人是不足。例如，拉茨+基因（編碼-半乳糖苷酶）將補充拉茨，-半乳糖苷酶缺乏宿主產(chǎn)生乳酸+收件人可以選擇為紅色菌落麥康凱瓊脂。（2） 抗生素抗性基因，這些基因賦予抵抗抗生素通常在易感細胞，這可以體現(xiàn)與質(zhì)粒進行基因四環(huán)素、氨芐西林耐藥和轉(zhuǎn)化，可以選擇對媒體包含這些抗生素之一：外源基因通常是克隆到基因編碼的抗其他抗生素，未經(jīng)選擇的抗生素。（3） 雜交一種廣泛使用的方法，分析收集的重組核酸分子或細胞克隆是由殖民地或斑塊雜交（噬菌斑雜交）。細胞含有重組基因轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素過濾器（尼龍膜）和溶解。純化，補充放射性核酸雜交的互補脫氧核糖核酸在硝化纖維方向的細胞。雜交，可以用放射自顯影檢測。雜交的程度將反映的互補性。復制脫氧核糖核酸合成的基因模板也可用于屏幕的基因重組必將硝化棉過濾器以類似的方式。（4） 限制性內(nèi)切酶分析，這種方法可以用來確定是否克隆基因產(chǎn)生相同大小的碎片，作為一個標準的核酸分子。限制性內(nèi)切酶分析提供映射片段往往是一個先決條件，序列分析。（五）免疫學方法免疫學方法的使用也越來越多，在很大程度上取決于發(fā)展的抗體，主要是對蛋白質(zhì)產(chǎn)品。鑒定重組脫氧核糖核酸是一種高度保密方面的工業(yè)克隆方案和大部分研究的結(jié)果將仍然享有特權(quán)的信息。這是一個不可避免的，但遺憾方面的商業(yè)重要性，這些新技術(shù)。遺傳工程必須被正確地視為頂點的大框架的應用遺傳學已開發(fā)成功在過去三年。然而，這當然是最令人興奮的和潛在的最有創(chuàng)意的技術(shù)提供給工業(yè)遺傳學家?？茖W和經(jīng)濟應用基因重組技術(shù)是無限的，包括：（一）增加產(chǎn)量的特定基因的產(chǎn)品。（二）提高利率的合成一種特定的最終產(chǎn)品的克隆更多的酶在生物體或通過專門改變克隆酶的定點突變（例如克隆節(jié)能氮途徑從大腸桿菌為卜內(nèi)門單細胞蛋白生物來）。（三）“剪裁”有機體轉(zhuǎn)移特定活動的一個更理想的宿主生物體。 基因重組技術(shù)將有重大影響的醫(yī)藥產(chǎn)品在不久的將來。它現(xiàn)在可以將基因從哺乳動物來源為細菌和獲得生產(chǎn)以商業(yè)規(guī)模的產(chǎn)品編碼的這些基因的哺乳動物?；衔锾貏e重要，包括胰島素，人體生長激素，酶，抗體，干擾素和疫苗。時間尺度的發(fā)展和商業(yè)應用，希望將允許這些產(chǎn)品可后來這十年。在獸醫(yī)領(lǐng)域新的動物疫苗的遺傳工程不久將面世。雖然克隆的外源基因現(xiàn)在是例行的大腸桿菌，一個主要問題是，這種生物體分泌很少蛋白質(zhì)分泌。蛋白質(zhì)的特點是信號序列，主要由疏水性氨基酸殘基決定了蛋白質(zhì)的出口跨越細胞膜。在出口過程他信號肽裂解產(chǎn)生的蛋白或激素。這部分的問題是可以克服由大腸桿菌融合基因所需的產(chǎn)品與另一個外源基因的基因產(chǎn)品出口；另一種方法是使細胞更漏。然而，其他細菌、如枯草芽孢桿菌，其中正成為越來越多地用于基因工程和排泄超過50蛋白質(zhì)，無疑會找到更多的使用在工業(yè)應用中的外源基因的克隆。 在長期的最有潛力的基因重組技術(shù)應在農(nóng)業(yè)部門的可能性。固氮基因的細菌進入重要的作物比其他豆類正在積極研究。同樣的可能性轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)基因控制固氮根瘤菌豆科植物協(xié)會也正在研究。 在未來的許多其他生物技術(shù)領(lǐng)域，包括能源和化工原料和廢物處理將受益于應用能力的遺傳學家，產(chǎn)生理想的生物所需的目的。雖然現(xiàn)在有許多遺傳操作，可以進行生物體，值