水稻基因組學(xué)的的研究進展.doc

基因組學(xué)課程論文所在學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 專 業(yè) 14級生物技術(shù)（植物方向） 姓 名 金祥棟 學(xué) 號 2014193012 水稻基因組學(xué)的研究進展摘 要：隨著模式植物擬南芥和水稻基因組測序的完成，近年來關(guān)于植物基因組學(xué)的研究越來越多。水稻是世界上重要的糧食作物之一，養(yǎng)活著全世界近一半的人口。同時南于水稻基岡組較小、易于轉(zhuǎn)化及與其他禾本科植物基因組的同線性和共線性等特點，一直被作為禾本科植物基因組研究的模式作物。水稻基因組測序的完成及種質(zhì)資源的基因組重測序，為水稻功能基因組研究奠定了基礎(chǔ)。現(xiàn)綜述我國水稻基因組測序和功能基因組研究歷史，重點介紹了近年來在水稻基因組序列分析中獲得的幾項最新的研究結(jié)果。關(guān)鍵詞 ： 水稻 ；基因組測序 ；功能基因組 ；研究歷史 ；基因組學(xué)；研究進展 The recent progress in rice genomics researchAbstract: With the completion of genome sequencing ofthe model plant- Arabidopsis and rice，more and more researches on plant genomics emerge in recent years. Rice is one of the most important crops in the world, raised nearly half of the world population. At the same time in south rice Keegan group is smaller, with linear and linear features such as easy transformation and other gramineous plant genome, has been used as a model crop for plant genome research of Gramineae. Genome sequencing and germplasm resources the rice genome sequencing completed laid the foundation for rice functional genomics research. This article reviews the history and function of our genome sequencing of rice genome research, introduces several latest research results in recent years in the analysis of rice genome sequences.前言基因組是1924年提出用于描述生物的全部基因和染色體組成的概念，是研究生物基因結(jié)構(gòu)與功能的學(xué)科，是在遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門現(xiàn)代生物技術(shù)前沿科學(xué)，也是現(xiàn)代分子生物學(xué)和遺傳工程技術(shù)所必要學(xué)科，是當(dāng)今生物學(xué)研究領(lǐng)域最熱門、最有生命力、發(fā)展最快的前沿科學(xué)之一?；蚪M學(xué)的主要任務(wù)是研究探索生物基因結(jié)構(gòu)與功能，生物遺傳和物理圖譜構(gòu)建，建立和發(fā)展生物信息技術(shù)，為生物遺傳改良及遺傳病的防治提供相關(guān)技術(shù)依據(jù)。進入 21 世紀(jì)，隨著全球化、市場化農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展和全球貿(mào)易一體化格局的逐步形成，我國種業(yè)正面臨前所未有的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，主要表現(xiàn)在 ：依靠傳統(tǒng)育種技術(shù)難以大幅度提高糧食單產(chǎn) ；土地資源短缺，農(nóng)業(yè)環(huán)境污染日益突出 ；種質(zhì)資源發(fā)掘、基因組育種技術(shù)亟需創(chuàng)新等。水稻不僅是重要的糧食作物，由于其基因組較小且與其他禾本科作物基因組存在共線性，以及具有成熟高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，已成為作物功能基因組研究的模式植物。因此，水稻基因組研究對發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)作物育種技術(shù)、提升種業(yè)國際競爭力和保障糧食有效供給具有重大戰(zhàn)略意義?；蚪M研究主要包括三個層次:結(jié)構(gòu)基因組學(xué)，以全序列測序為目標(biāo)，構(gòu)建高分辨率的以染色體重組交換為基礎(chǔ)的遺傳圖譜和以DNA 的核苷酸序列為基礎(chǔ)的物理圖譜。功能基因組學(xué)，即“后基因組計劃”， 是結(jié)構(gòu)基因組研究的延伸， 利用結(jié)構(gòu)基因組提供的遺傳信息， 利用表達序列標(biāo)簽， 建立以轉(zhuǎn)錄圖譜為基礎(chǔ)的功能圖譜( 基因組表達圖譜） ， 系統(tǒng)研究基因的功能，植物功能基因組學(xué)是當(dāng)前植物學(xué)最前沿的領(lǐng)域之一。蛋白質(zhì)組學(xué)，是功能基因組學(xué)的深入，因為基因的功能最終將以蛋白質(zhì)的形式體現(xiàn)。水稻( Oryza sativa）是第一個被全基因組測序的作物，目前栽培稻2個亞種全基因組測序工作已經(jīng)完成：粳稻品種日本晴(Nipponbare)通過全基因組鳥槍法和逐步克隆法被測序，秈稻品種揚稻6號(9311)通過全基因組鳥槍法被測序。除核基因組外，水稻葉綠體和線粒體基因組也于1989年和2002年分別被測序。水稻2個亞種的全基因組測序完成，一方面開啟了植物比較基因組學(xué)的大門，另一方面為人們在基岡組水平上鑒定出所有水稻基因并分析其功能奠定了基礎(chǔ)，同時也使得人們對植物進化的認(rèn)識，尤其是對禾本科植物進化的了解，逐步從系統(tǒng)分類和分子標(biāo)記水平進入到了基因組序列水平。許多研究者通過對水稻基因組序列的分析，利用生物信息學(xué)工具，對水稻在基因組水平上的進化進行了大量研究。1、水稻基因組學(xué)的研究1.1、水稻基因組測序的開啟水稻基因組測序相對簡單然而最終目的不是測序注釋序列認(rèn)識基因的內(nèi)含子或外顯子的結(jié)構(gòu)更重要的是知道每個基因的功能。水稻反向遺傳學(xué)和插入引起的突變?yōu)樗竟δ芑蚪M研究提供了強有力的工具。繼“人類基因組計劃”“擬南芥基因組計劃”提出之后，各國科學(xué)家為搶奪下一個生物學(xué)科研前沿，將水稻基因組計劃提上日程。 1991 年日本將水稻基因組制圖列入研究規(guī)劃。我國于 1990年開始研討水稻基因組測序，并于 1992 年正式宣布開展水稻基因組測序，同時在上海成立了中國科學(xué)院國家基因研究中心。歷時 4 年，中國在國際上率先完成了水稻 ( 秈稻 ) 基因組物理圖的構(gòu)建，為水稻基因組測序提供了材料基礎(chǔ)。 1997 年 9 月，日本和中國作為主要參與國牽頭發(fā)起“國際水稻基因組測序計劃” (International Rice Genome Sequencing Project, IRGSP)。 1998 年 2 月， IRGSP 正式啟動，主要內(nèi)容是開展水稻遺傳圖和物理圖的繪制，完成基因組序列的測定及基因序列的注釋分析等工作。IRGSP 確定以主要栽培品種粳稻“日本晴”作為測序?qū)ο?，基于基因組物理圖譜進行測序。水稻12 條染色體的測序工作分別由日本 (6 條 )、美國 (3條 )、中國 (1 條 )、中國臺灣 (1 條 )、法國 (1 條 )承擔(dān)，其中印度、韓國、巴西等參與了部分染色體的測序工作。中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院國家基因研究中心作為中國大陸的參加單位，承擔(dān)第 4號染色體的測序工作。由于水稻種質(zhì)資源豐富且控制重要農(nóng)藝性狀的基因存在大量的序列變異，隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展及測序成本降低，近年來開展了大量種質(zhì)的基因組重測序。 2011 年，我國科學(xué)家對 50 個水稻品種進行基因組重測序并構(gòu)架遺傳變異數(shù)據(jù)庫，首次對野生稻和栽培稻的基因組進行大規(guī)模的遺傳多樣性分析，為挖掘野生稻優(yōu)良基因，加快高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)水稻品種培育奠定了理論基礎(chǔ)。1.2我國水稻功能基因組研究計劃水稻基因組序列的獲得為基因功能研究奠定了基礎(chǔ)?！肮δ芑蚪M學(xué)”的主要任務(wù)是解析這些序列的功能及組裝結(jié)構(gòu)，并在此基礎(chǔ)上揭示各種生命現(xiàn)象所涉及的基因及其表達調(diào)控的機理，最終闡明基因組的功能。我國在水稻基因組測序取得進展的同時，適時啟動了水稻功能基因組研究。 1999 年，科技部通過國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (“973”項目 ) 和國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (“863”計劃 ) 開始資助中國水稻功能基因組研究。起初，中國水稻功能基因組研究主要包括 3 部分內(nèi)容 ： (1) 建立功能基因組研究平臺 ； (2) 開展重要農(nóng)藝性狀功能基因組研究 ； (3) 重要基因的分離克隆和功能分析。隨著水稻功能基因組研究的深入，逐步拓展了功能基因組組學(xué)研究平臺，主要包括：種質(zhì)資源、轉(zhuǎn)錄組、表觀組、代謝組、表型組及生物信息數(shù)據(jù)庫等組學(xué)平臺。重要農(nóng)藝性狀功能基因組研究主要包括功能基因和調(diào)控因子的分離克隆、重要農(nóng)藝性狀形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析。功能基因組研究的最終目標(biāo)是應(yīng)用于基因組技術(shù)育種，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的水稻新品種。2 水稻基因組的測序2.1遺傳圖譜水稻是已知的單子葉植物中基因組最小的植物之一，基因組大小為450 Mb， 共有12 條染色體。自1988年MeCoueh等6利用IR34583(秈）Bulu Dalam(爪哇）的F2群體構(gòu)建了第一張水稻分子連鎖圖譜(含135 RFLP標(biāo)記）以來，高密度的圖譜相繼產(chǎn)生。近年來，隨著分子遺傳學(xué)的迅速發(fā)展，國際水稻基因組測序計劃(International Rice GenomeSequencing Project，IRGSP）成員國以Nipponbare、Kasalath、IR64和Azucena等水稻品種為材料，構(gòu)建了10個飽和的遺傳圖譜并與表型的標(biāo)記進行了整合，以創(chuàng)造新的遺傳資源。1998年，Harushima等7構(gòu)建了一張高密度水稻遺傳連鎖圖，包含2275個遺傳標(biāo)記，覆蓋水稻基因組15216 cM。2001年Rice Genome Program(RGP）公布了包含3 267個RFLP分子標(biāo)記的水稻分子連鎖圖。還利用次級三體和終級三體(telotrisomics）將經(jīng)典遺傳圖和分子遺傳圖中的著絲粒位置確定，修正了分子圖譜的方向，把RFLP標(biāo)記定位到特定的染色體臂上；Wu等8構(gòu)建了水稻第11和第12染色體短臂末端重復(fù)基因組區(qū)域的圖譜，重復(fù)基因組區(qū)域大小是25 Mb，表明水稻也存在大染色體片段的重復(fù)區(qū)域。上述遺傳圖譜在基因定位、物理圖譜的構(gòu)建和基因測序中發(fā)揮了或即將發(fā)揮巨大作用。2.2 物理圖譜水稻物理圖譜的構(gòu)建有利于以圖位克隆技術(shù)分離目的基因 ,因此 ,基因物理定位研究是水稻基因組研究計劃的一個重要方面 。國際水稻基因組測序計劃(IRGSP）已于2002年12月宣布，利用克隆連克隆(逐步克?。y定法(clone by clone sequencing），提前3年完成了水稻12條染色體的堿基測序工作。日本在其中發(fā)揮著主導(dǎo)作用，并最先以9999的精度完成了最長的第1條染色體的測序工作。另外，中國12家單位，于1998年至2001年利用全基因組霰彈法(whole- genome shotgun sequencing，WGS），構(gòu)建了秈稻9311基因組工作框架圖和低覆蓋率的培矮64S草圖，并最先向全世界公布了水稻9311全基因組框架圖。隨后，美國先正達(Syngenta）公司也完成了日本晴基因組工作框架圖的測序。兩個框架圖同時發(fā)表在2002年4月的Science第296期第7999頁，它們都是對IRGSP的補充。水稻基因組框架圖和全長序列的精確測定雖已基本完成，但片段之間或重疊群之間仍存在一些缺口或空隙(gap），如秈、粳兩個亞種的基因組工作框架圖分別覆蓋了水稻全基因組的95.29和93，堿基準(zhǔn)確率約99。當(dāng)前基于物理圖精確測序的圖譜研究表明，水稻“日本晴”全基因組己獲得3721 Mb的高質(zhì)量精確序列，余下的5分布于12條染色體上的38個間隙(gaps）、10個著絲粒和10個端粒處；水稻全基因組預(yù)測有56278個基因位點，因為6498個基因位點編碼10432個轉(zhuǎn)錄本，所以總轉(zhuǎn)錄本為66710；如果去除15236個轉(zhuǎn)座因子相關(guān)的蛋白編碼基因后，共有41042個基因位點編碼非轉(zhuǎn)座因子相關(guān)的蛋白，平均9.4 kb含一個基因，其中約29的基因成族出現(xiàn)，約71與擬南芥基因(Arabidopsis，28000-29000個基因）享有同源性(反過來，約90的擬南芥基因與水稻基因享有同源性）。31439個基因位點已經(jīng)得到ESTs序列、全長cDNA序列、Tiling芯片檢測、大規(guī)模平行測序(massively parallel sigNature sequencing，MPSS）檢測的RNA轉(zhuǎn)錄水平上的確認(rèn)，8226個基因位點的編碼蛋白序列與功能已知的蛋白質(zhì)序列相同或相似，另有13632個基因位點的編碼蛋白含有已知的功能域。2.3 EST測序大規(guī)模的 ES T 測序?qū)ρ芯克净蚪M很有幫助, 分離和部分測序的 cDNA 克隆不僅有利于構(gòu)建RFLP 連鎖圖譜和物理圖譜 ,而且還可以了解各類同功酶和基因家族的表達機理。大規(guī)模的 EST 測序的最終目的就是要將所有表達的基因進行分類 。 RGP 研究小組從水稻不同組織和愈傷組織中分離和部分測序了 29 000 個 cDNA 克隆, 這些堿基序列翻譯成氨基酸序列時存在 3 個可能的閱讀框, 通過PIR 數(shù)據(jù)庫同源性檢索 ,分析的 cDNA 序列與已知蛋白質(zhì)的編碼序列具有高度同源和相似性的克隆占25 %,還有 75 %的克隆編碼未知功能蛋白 9 。到目前為止, 公共的 ES T 數(shù)據(jù)庫中已有 68 000 水稻EST ,私有 ES T 數(shù)據(jù)庫中也有 120 000 多個 ES T , 這些 ES T 主要來自于 5 -末端, 但現(xiàn)在對應(yīng)克隆的3 -端也在測序 ,這就使我們可以探測多基因家族的不同成員, 有利于構(gòu)建全長 cDNA 10 。所有公共的水稻 EST 可分成大約 21 000 重疊克隆群 ,這樣就可以鑒定相同數(shù)目的表達基因, 許多表達基因與其它物種的基因表現(xiàn)出相似性。因為水稻富含 CG 的密碼子較多 ,只有在蛋白質(zhì)水平上進比較, 表明水稻與大多數(shù)植物和有機體分享相同的基因,但水稻 ESTs 的 30 %與鑒定的無同源性 。這就揭示在了解水稻基因功能前存在間隙 ,另一方面, 盡管水稻的密碼子較多, 擬南芥 ES Ts 的 1 % 2 %與水稻 ESTs在核苷酸序列水平相一致 11 ,這些保守序列可與許多不同基因組雜交 ,爾后進行線性排列。2 .4基因組測序國際水稻基因組測序計劃 ( IRGSP) 由 1997 年在新加坡舉行的植物分子生物學(xué)會議發(fā)起 ;1998 年 ,中國、日本、美國和韓國的代表共同草擬了資源共享等組織議程 ;2000 年在美國的 C1emson 召開了協(xié)調(diào)會 ,對 12 條染色體測序任務(wù)進行了分工 (表 1) 。 測序工作分為測序、填補缺口和最后完成三個階段。對于最后測序結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn) , IRGSP 規(guī)定為誤差率低于 1/ 10000 (精度 99. 99 %) 。 第二階段是測序工作的瓶頸 ,測序階段留下的缺口需要補平 ,水稻特殊序列組成 (易于形成二級結(jié)構(gòu)和 GC 富集區(qū)) 和重復(fù)序列造成的低質(zhì)量測序結(jié)果需要改進22 。 通過各研究機構(gòu)和私營公司的共同努力 , IRGSP 已于 2002 年 12月宣布 ,利用克隆連克隆 (逐步克隆) 測定法 (cloneby clone sequencing) ,提前 3 年完成了水稻 12 條染色體的堿基測序工作。3 水稻基因組的信息3.1水稻基因組的概述水稻基因組有 12 條染色體 ,第 1 染色體最長 ,第 10 染色體最短 ;核基因組序列總長約 430 Mb ,是擬南芥基因組的 3. 7 倍或人類基因組的 1/ 6. 7 ,預(yù)測基因總數(shù)達 32 00056000 個 ,可能多于人類基因總數(shù)。秈稻是亞洲和世界其他一些地方廣為種植的主要水稻亞種 ,同時也是我國雜交水稻的主要遺傳背景之一 ,為解決中國人民的糧食問題作出了巨大貢獻。 秈稻 93211 基因組框架圖 ,共完成 462 萬個成功反應(yīng) ,得到了 127 550 個重疊群 ,覆蓋深度為 4. 2 ,預(yù)測基因組長 466 Mb ,實測的全長非冗余序列為409. 76 Mb ,大約覆蓋了水稻全基因組的 95129 % ,堿基準(zhǔn)確率大于 99 % ;估計基因的大小為 4 500 bp ,預(yù)測基因數(shù)為 4. 6 萬5. 6 萬個 ,拷貝基因占基因總數(shù)的 74 % ,轉(zhuǎn)位因子占全基因組的 2419 % ,簡單重復(fù)序列數(shù)為全基因組的 2. 1 % ;基因內(nèi) GC 含量的梯度明顯 ;外顯子變異少、內(nèi)含子變化大 ;水稻與玉米、小麥和大麥之間有廣泛的共線性 ,但水稻與擬南芥的共線性是有限的。3. 2水稻全基因組的完成圖水稻基因組框架圖和全長序列的精確測定雖已基本完成 ,但片段之間或重疊群之間仍存在一些缺口或空隙 (gap) ,如秈、粳兩個亞種的基因組工作框架圖分別覆蓋了水稻全基因組的 95. 29 %和 93 % ,堿基準(zhǔn)確率約 99 % ;第 1 染色體和第 4 染色體的全長序列之間也分別還有 8 個和 7 個缺口。 由于無數(shù)重復(fù)序列 ,第 1 染色體 390 個 PAC/ BAC 克隆中有 4個克隆仍缺乏一致性 ,還屬于測序的第 1 階段 ;16個克隆屬于第 2 階段 ,370 個克隆屬于第 3 階段。 框架圖仍需增加更大片段讀序 ,構(gòu)建更大跨度的重疊群(支架) ,填充這些順序間隙 ( sequence gap) 和物理間隙 (physical gap ) ,結(jié)合現(xiàn)有的物理圖 ,改善框架圖。 全長序列還可用熒光標(biāo)記終止法、引物步查法和少核苷酸的 PCR 反應(yīng)等方法填補缺口或糾正組裝錯誤。 最終 ,為世界上所有從事水稻以及其他禾谷類作物研究的生物學(xué)家和遺傳學(xué)家提供一個高度準(zhǔn)確并進行精細注釋的水稻基因組完成圖。4 未來水稻功能基因組學(xué)的發(fā)展趨勢4.1水稻2020研究計劃(RICE 2020)RICE 2020 計劃是我國科學(xué)家基于全球水稻功能基因組研發(fā)現(xiàn)狀和生物技術(shù)手段的不斷創(chuàng)新，適時提出的關(guān)于水稻功能基因組研究中長期發(fā)展的國際合作計劃，包括以下主要內(nèi)容 ：建立國際共享的水稻功能基因組研究的技術(shù)平臺和基因資源 ；解碼水稻全部基因的生物學(xué)功能 ；開展系統(tǒng)的表觀基因組學(xué)和基因表達分析研究，明確基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；建立蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)互作組 ；挖掘栽培稻和野生稻的自然變異和基因組多樣性 ；發(fā)展生物信息學(xué)，建立海量數(shù)據(jù)搜索和分析的數(shù)據(jù)庫平臺 ；建立以基因組研究成果為基礎(chǔ)的分子設(shè)計育種技術(shù)。我國水稻功能基因組在 RICE 2020 計劃的指導(dǎo)下已取得傲人成果，但考慮到水稻基因組的復(fù)雜性， RICE2020 計劃的總體目標(biāo)仍然是下一階段水稻功能基因組研究的燈塔。4.2重要農(nóng)藝性狀形成的分子網(wǎng)絡(luò)解析 我國水稻功能基因組研究始終以水稻重要農(nóng)藝性狀的分子網(wǎng)絡(luò)剖析和基因組遺傳改良對技術(shù)和基因資源的需求為導(dǎo)向。經(jīng)過幾輪水稻功能基因組項目的實施，我國在水稻產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病蟲、抗逆、養(yǎng)分高效利用等重要農(nóng)藝性狀功能基因解析方面取得突破性進展，相關(guān)的功能基因及其調(diào)控機制表現(xiàn)出較好的育種應(yīng)用前景。由于重要農(nóng)藝性狀形成的分子網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，目前獲得的功能基因仍然屈指可數(shù)，相關(guān)的分子調(diào)控機制了解還不透徹。因此，重要農(nóng)藝性狀形成的分子網(wǎng)絡(luò)解析在相當(dāng)長的一段時期內(nèi)仍然是水稻功能基因組研究的重點。未來水稻功能基因組研究將進一步發(fā)掘種質(zhì)資源的多樣性，拓展轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)研究平臺，分離克隆控制水稻重要農(nóng)藝性狀的功能基因及調(diào)控元件，應(yīng)用于水稻重要農(nóng)藝性狀的遺傳改良。4.3水稻4D基因組學(xué)(RICE 4Dome) 基于水稻基因組測序技術(shù)的革新及已有的功能基因組研究平臺，從整體上開展水稻 4D 基因組學(xué)研究已成為今后水稻功能基因組研究新的增長點。針對水稻重要性狀的生物學(xué)問題 ( 產(chǎn)量、抗逆、品質(zhì)、雜種優(yōu)勢等 )，系統(tǒng)研究水稻基因組三維空間結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化對基因轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、調(diào)控等生物過程的作用機制，對解析水稻生長發(fā)育環(huán)境適應(yīng)的分子機理，指導(dǎo)水稻的遺傳改良有重大意義。4.4全基因組育種技術(shù) 充分利用高通量測序技術(shù)獲得的大量水稻品種重測序結(jié)果，將世界上最先進的分子標(biāo)記檢測技術(shù)和我國 10 多年的水稻基因組研究成果積累結(jié)合起來，開展水稻全基因組選擇育種技術(shù)，搭建了水稻全基因組育種芯片技術(shù)平臺，有望現(xiàn)育種過程的科學(xué)控制 ：有目的地選擇優(yōu)良性狀相關(guān)位點進行組合，創(chuàng)造優(yōu)良基因型 ；在導(dǎo)入目標(biāo)性狀，使受體親本主要缺點得到改良的情況下，高度保持其原有優(yōu)良性狀。該技術(shù)將對促進我國育種行業(yè)轉(zhuǎn)型，從傳統(tǒng)育種向以基因組信息為依據(jù)的科學(xué)育種起到重要影響，提高我國種業(yè)創(chuàng)新能力以及與國際種業(yè)巨頭競爭的實力。水稻全基因組選擇育種技術(shù)平臺的建設(shè)和育種應(yīng)用將為我國其他作物的全基因組選擇育種技術(shù)提供示范和經(jīng)驗。參考文獻1.Galbraith D W, Harkins K R, Maddox J R, et al . Rapid Flow Cytometric Analysis of the Cell Cycle in Intact Plant TissuesJ. Science, 1983, (220):1049 1051.2.BvanM, Bancroft I, Bent E, et al. Analysis of 1. 9 Mb of C