川貝母 檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程.doc

川貝母檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼：S0P-QC-ZJ-3017-03 題 目 川貝母檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程制定部門：質(zhì)量檢驗中心頒發(fā)部門：質(zhì)量管理部分發(fā)部門：質(zhì)量管理部、質(zhì)量檢驗中心制定人： 日期: 年 月 日 審核人： 日期: 年 月 日批準(zhǔn)人： 日期： 年 月 日生效日期: 2012年 10 月 1 日變更歷史：1.2003年3月制定； 2.2005年7月執(zhí)行中國藥典2005年版第一次修訂； 3.2010年10月執(zhí)行中國藥典2010年版第二次修訂。4.2012年10月1日執(zhí)行中國藥典2010年版第一增補本第三次修訂。 目 的：建立川貝母檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。規(guī)范檢驗操作，確保川貝母質(zhì)量。適用范圍：適用于川貝母的檢驗。責(zé) 任 者：質(zhì)量管理部經(jīng)理、質(zhì)檢中心主任、質(zhì)量檢驗員。內(nèi) 容： 1品名：川貝母 2取樣：按藥材和飲片取樣標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP-QC-ZJ-6065）取樣 3檢驗依據(jù)：川貝母內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（STP-QS-ZJ-3015） 4性狀松貝 取本品，置明亮處用肉眼觀察，呈類圓錐形或近球型,尺量，高0.30.8cm，直徑0.30.9cm。，表面類白色。外層鱗葉2瓣，大小懸殊，大瓣緊抱小瓣，未抱部分呈新月形，習(xí)稱“懷中抱月”；頂部閉合，內(nèi)有類圓形，頂端稍尖的心芽和小鱗葉12枚；先端鈍圓或稍尖，微凹入，中心有1灰褐色的鱗莖盤，偶有殘存須根。質(zhì)硬而脆，斷面白色，富粉性。氣微，味微苦。 青貝 呈類扁球形，高0.41.4cm，直徑0.41.6cm。外層鱗葉2瓣，大小相近，相對抱合，頂部開裂，內(nèi)有心芽和小鱗葉23枚及細(xì)圓柱形的殘莖。 爐貝 呈長圓形，高0.72.5cm，直徑0.52.5cm。表面類白色或淺棕黃色，有的具棕色斑點。外層鱗葉2瓣，大小相近，頂部開裂而略尖，基部稍尖或較鈍。 5鑒別： 5.1儀器：顯微鏡、超聲波清洗機、電子恒溫水浴鍋、薄層噴霧氣壓泵、電子天平 5.2試劑與試液 5.2.1試劑：二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、濃氨試液5.2.2試液水合氯醛試液：取水合氯醛50g，加水15ml與甘油10ml使溶解，即得。甘油乙醇試液：取甘油、稀乙醇各1份，混合，即得。碘化鉀溶液：取碘化鉀16.5g，加水使溶解成100ml，即得。臨用新制。稀碘化鉍鉀試液：取次硝酸鉍0.85g，加冰醋酸10ml與水40ml溶解后，即得。臨用前取5ml，加碘化鉀溶液（410）5ml，再加冰醋酸20ml，加水稀釋至100ml，即得。亞硝酸鈉乙醇試液：取亞硝酸鈉1g，加乙醇使溶解成100ml，即得。5.3對照品與：貝母辛對照品、貝母素乙對照品5.4操作方法 5.4.1按顯微鑒別法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP-QC-ZJ-6034）檢查。松貝、青貝、 取本品粉末10g，過四號篩，平鋪于潔凈的白紙上，在明亮處用肉眼觀察，本品粉末類白色。挑取少許置載玻片上，滴加水合氯醛試液2滴，將載玻片置酒精燈火焰上方2cm處往返擺動加熱至邊緣起小泡，即停止加熱，補充試液后再加熱，直至透化完全。透化后放冷，加甘油乙醇2滴，蓋上蓋玻片。置顯微鏡下觀察，淀粉粒甚多，廣卵形、長圓形或不規(guī)則圓形，有的邊緣不平整或略作分枝狀，直徑564m，臍點短縫狀、點狀、人字狀或馬蹄狀，層紋隱約可見。表皮細(xì)胞類長方形，垂周壁微波狀彎曲，偶見不定式氣孔，圓形或扁圓形。螺紋導(dǎo)管直徑526m。爐貝 取本品粉末10g，過四號篩，平鋪于潔凈的白紙上，在明亮處用肉眼觀察，本品粉末類白色。挑取少許置載玻片上，滴加水合氯醛試液2滴，將載玻片置酒精燈火焰上方2cm處往返擺動加熱至邊緣起小泡，即停止加熱，補充試液后再加熱，直至透化完全。透化后放冷，加甘油乙醇2滴，蓋上蓋玻片。置顯微鏡下觀察，淀粉粒廣卵形、貝殼形、腎形或橢圓形，直徑約至60m，臍點人字狀，星狀或點狀，層紋明顯。 5.4.2 取本品粉末10g，置具塞小錐形瓶中加濃氨試液10ml，密塞，浸泡1小時，加二氯甲烷40ml，超聲處理1小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇O.5mI使溶解，作為供試品溶液。另取貝母素乙對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液.作為對照品溶液。按薄層色譜法（附錄VI B）試驗，吸取供斌品溶液16l、對照品溶液2l，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液-水(18：2：1：0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，依次噴以稀碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。 5.4.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法。 模板DNA提取 取本品0.1 g，依次用75 %乙醇1ml、滅菌超純水1ml清洗，吸干表面水分，置乳缽中研磨成極細(xì)粉。取20mg，置1.5ml離心管中，用新型廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA：加入緩沖液AP1 400 L和RNA酶溶液（10 mg/ml）4L，渦旋振蕩，65 水浴加熱10分鐘，加入緩沖液AP2 130L，充分混勻，冰浴冷卻5分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘14000轉(zhuǎn)）10分鐘；吸取上清液轉(zhuǎn)移入另一離心管中，加入1.5倍體積的緩沖液AP3/E，混勻，加到吸附柱上，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘13000轉(zhuǎn)）1分鐘，棄去過濾液，加入漂洗液700 L，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）30秒，棄去過濾液；再加入漂洗液500 L，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）30秒，棄去過濾液；再離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘13000轉(zhuǎn)）2分鐘，取出吸附柱，放入另一離心管中，加入50L洗脫緩沖液，室溫放置35分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）1分鐘，將洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）1分鐘，取洗脫液，作為供試品溶液，置4 冰箱中備用。另取川貝母對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材模板DNA溶液。 PCR-RFLP反應(yīng) 鑒別引物：5CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3和5GCTACGTTCTTCATCGAT3。PCR反應(yīng)體系：在200 L 離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為30 L，反應(yīng)體系包括10 PCR緩沖液3 L，二氯化鎂（25 mmol/L）2.4 L，dNTP（10 mmol/L）0.6 L，鑒別引物（30 mol/L）各0.5 L，高保真Taq DAN聚合酶（5 U/L）0.2L，模板1L，無菌超純水21.8 L。將離心管置PCR儀，PCR反應(yīng)參數(shù)：95預(yù)變性4分鐘，循環(huán)反應(yīng)30次（95 30秒，5558 30秒，72 30秒），72 延伸5分鐘。取PCR反應(yīng)液，置500 L離心管中，進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)總體積為20 L，反應(yīng)體系包括10 酶切緩沖液2 L，PCR反應(yīng)液6 L，Sma I（10 U/L）0.5 L，無菌超純水11.5 L，酶切反應(yīng)在30 水浴反應(yīng)2小時。另取無菌超純水，同法上述PCR-RFLP反應(yīng)操作，作為空白對照。電泳檢測 照瓊脂糖凝膠電泳法，膠濃度為1.5 %，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRad，供試品與對照藥材酶切反應(yīng)液的上樣量分別為8LDNA，DNA分子標(biāo)記上樣量為1 L（0.5g/L）。電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。供試品凝膠電泳圖譜中，在與對照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，在100250 bp應(yīng)有兩條DNA條帶，空白對照無條帶。 6檢查6.1水分：按水分測定法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP-QC-ZJ-6020）烘干法測定，不得過15.0%。6.1.1儀器：鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱、電子天平。6.1.2操作方法：接通電子天平電源，啟動電子天平，使電子天平預(yù)熱30分鐘。取潔凈的稱量瓶，置烘箱內(nèi)100105干燥2小時，取出，置干燥器中室溫放置30分鐘，精密稱定重量，再置烘箱內(nèi)100105干燥1小時，取出置干燥器中室溫放置30分鐘，精密稱定重量，直至連續(xù)兩次干燥后稱重的差異在0.3mg以下為止。取供試品最粗粉25g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5mm。精密稱定，記錄數(shù)據(jù)，打開瓶蓋在100105干燥5小時，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30分鐘，精密稱定，再在上述溫度干燥1小時 ，冷卻，稱重，并記錄數(shù)據(jù)，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5mg為止。根據(jù)減失的重量，計算出供試品中含水量(%)。6.2總灰分：按灰分測定法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP-QC-ZJ-6016)總灰分測定法測定，不得過5.0%。6.2.1儀器：節(jié)能電阻爐、電子天平、坩鍋。6.2.2操作方法：接通電子天平電源，啟動電子天平，使電子天平預(yù)熱30分鐘。取潔凈的坩堝，置節(jié)能電阻爐內(nèi)，將坩堝蓋斜蓋于坩堝上，經(jīng)加熱至600熾灼約1小時，停止加熱，待節(jié)能電阻爐溫度冷卻至約300，取出坩堝，置干燥器內(nèi)，蓋好坩堝蓋，放冷至室溫，精密稱定重量，再以同樣條件重復(fù)操作，直至連續(xù)兩次干燥后稱重的差異在0.3mg以下為止。取能通過二號篩并混合均勻的粉末23g，置熾灼至恒重的坩堝中，在電子天平上精密稱定，放入節(jié)能電阻爐內(nèi)，緩緩熾熱，至完全炭化呈黑色，逐漸升高溫度至500600，停止加熱，待節(jié)能電阻爐溫度冷卻至約300，取出觀察 ，直至完全灰化，取出坩堝，置干燥器內(nèi)，蓋好坩堝蓋，放冷至室溫，精密稱定重量，再以同樣條件重復(fù)操作，直至連續(xù)兩次熾灼后稱重的差異在0.3mg以下為止。并記錄數(shù)據(jù)。根據(jù)殘渣重量，計算供試品中總灰分的含量。 6.3浸出物：按浸出物測定法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP-QC-ZJ-6015）項下的熱浸法測定，用稀乙醇作溶劑，不得少于9.0%。 6.3.1儀器：鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱、 電子天平、電子恒溫水浴鍋。 6.3.2試劑：稀乙醇：取乙醇53ml，加水制成100ml即得。6.3.3操作方法：接通電子天平電源，啟動電子天平，使電子天平預(yù)熱30分鐘。取潔凈的蒸發(fā)皿，置烘箱內(nèi)100105干燥1小時，取出，置干燥器中室溫放置30分鐘，精密稱定重量，再置烘箱內(nèi)100105干燥1小時，取出置干燥器中室溫放置30分鐘，精密稱定重量，直至連續(xù)兩次干燥后稱重的差異在0.3mg以下為止。 取能通過二號篩并混合均勻的供試品約4g，置250ml的錐形瓶中，精密加稀乙醇100ml，密塞，稱定重量，靜置1小時后連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1小時。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于100105干燥3小時 ，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量。并記錄數(shù)據(jù)。除另有規(guī)定外，以干燥品計算供試品浸出物的含量。 6.4二氧化硫殘留量：按二氧化硫殘留量測定法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP-QC-ZJ-6062）測定，不得過150mg/kg。6.4.1儀器：SO2測定裝置（1000ml）、電熱套、10ml棕色滴定管、250ml錐形 瓶、磁力攪拌器、100ml量筒。 6.4.2試液6mol/L鹽酸溶液：取鹽酸54ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。淀粉指示液：本液應(yīng)臨用新制。取可溶性淀粉0.5g，加水5ml攪勻后，緩慢傾入100ml沸水中，隨加隨攪拌繼續(xù)煮沸2分鐘，放冷，傾取上層清液，即得。0.01mol/L碘滴定液： 6.4.3 儀器裝置：A為1000ml兩頸圓底燒瓶；B為豎式回流冷凝管；C 為（帶刻度)分液漏斗；D 為連接氮氣流入口；E 為二氧化硫氣體導(dǎo)出口； 6.4.4操作方法： 取藥材細(xì)粉約10g，精密稱定W，置兩頸圓底燒瓶中， 加水300400ml（應(yīng)加水至沒過氮氣導(dǎo)氣管的下端），取6mol/L鹽酸溶液10ml加入帶刻度分液漏斗中。錐形瓶里加入水125ml和淀粉指示液1ml作為吸收液，置于磁力攪拌器上不斷攪拌。打開冷凝管，將冷凝管的上端口處連接一橡膠導(dǎo)氣管置于錐形瓶內(nèi)液面以下。連接導(dǎo)氣管入口。開通氮氣，調(diào)節(jié)適宜的氣體流量（氮氣流速約為0.2L/min,至蒸餾瓶內(nèi)有氣泡均勻排出）。打開帶刻度分液漏斗的活塞，使鹽酸溶液10ml流入燒瓶中。給兩頸燒瓶內(nèi)的溶液加熱至沸，并保持微沸約3分鐘后開始用碘滴定液（0.01mol/L）滴定，吸收液置于磁力攪拌器上不斷攪拌，至吸收液顯藍(lán)色或藍(lán)紫色持續(xù)30秒鐘不完全消褪，記錄樣品消耗滴定液體積A；并用空白試驗校正，記錄消耗滴定液體積B。每1ml的碘滴定液（0.01mol/L）相當(dāng)于0.6406mg的SO2。C為碘滴定液濃度的校正因子 7含量測定 ：按紫外-可見分光光度法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP-QC-ZJ-6035）測定。7.1儀器：分光光度計、電子天平、電子恒溫水浴鍋。7.2試劑：三氯甲烷、甲醇試液0.05溴甲酚綠緩沖液：取溴甲酚綠0.05g，置100ml容量瓶中，加入0.2mol/L氫氧化鈉溶液6ml，振搖使溶解，加磷酸二氫鉀1g，加水使溶解并稀釋至刻度，即得7.3對照品：西貝母堿對照品 7.4操作方法對照品溶液的制備 精密稱取西貝母堿對照品5mg，置25ml棕色量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，制成濃度為C對（每1ml含0.2mg）的溶液，即得。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4m1、0.6ml、1.0ml，置25ml具塞刻度試管中，分別補加三氯甲烷至10.0ml，再用大肚吸管精密加水5ml、再精密加0.05溴甲酚綠緩沖液2m1，密塞，劇烈振搖，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，放置30分鐘。取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以三氯甲烷試劑為空白試劑，按紫外-可見分光光度法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP-QC