陳宏志開題報(bào)告

探究Seipin基因與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及成脂肪分化的關(guān)系,專 業(yè) ：病理學(xué)與病理生理學(xué)研 究 生 ：陳宏志 指 導(dǎo) 老 師：龐麗娟 副教授 李 鋒 教 授,2014級(jí)研究生開題報(bào)告,匯報(bào)內(nèi)容,研究背景 研究目的及意義研究?jī)?nèi)容方法和技術(shù)路線主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)已做的準(zhǔn)備工作經(jīng)費(fèi)預(yù)算,研究背景,人類Seipin基因定位于染色體11q13,由Magre等在2001年通過定位克隆的方法從9個(gè)先天性全身脂肪營(yíng)養(yǎng)不良(CGL)的家系中篩選出來。Seipin基因的無義突變與2型CGL密切相關(guān)，該患者缺失幾乎全部的脂肪組織。,研究背景：Seipin基因突變的表現(xiàn),Seipin突變,全身脂肪缺失,肌肉增多,黑棘皮癥,雄激素過多,肝腫大及脂肪肝,食欲亢進(jìn),肌肉中脂質(zhì)沉積,主要方面,代謝方面,生殖方面,激素水平,其他方面,高甘油三酯血癥,胰島素抵抗,糖尿病,瘦素、脂聯(lián)素降低,不育,Human Molecular Genetics,2015,Vol.24,No.15 4238-4249,WT,SKO,WT,SKO,WT,SKO,黑色箭頭所指為附睪脂肪墊，顯示SKO 動(dòng)物的脂肪缺失；紅色箭頭所指位置為肝臟，顯示SKO 動(dòng)物的肝臟增大、顏色發(fā)白，提示脂質(zhì)沉積。,Journal of Chongqing Medical University 2013.Vol.38 No.1,兩種動(dòng)物不同放大倍數(shù)下附睪、皮下脂肪形態(tài),與WT 動(dòng)物相比，SKO 動(dòng)物脂肪細(xì)胞大小、形態(tài)不一，提示SKO 動(dòng)物脂肪組織發(fā)育不良。,Journal of Chongqing Medical University 2013.Vol.38 No.1,研究背景,Discov Med,2010,研究背景,干細(xì)胞,成骨分化,成脂分化,骨細(xì)胞,脂肪細(xì)胞,相互制約,seipin,研究背景,此消彼長(zhǎng),充質(zhì)干細(xì)胞,成骨細(xì)胞,脂肪細(xì)胞,體外誘導(dǎo)培養(yǎng),相關(guān)文獻(xiàn)一,相關(guān)文獻(xiàn)二,相關(guān)文獻(xiàn)三,提出問題,間充質(zhì)干細(xì)胞,前脂肪細(xì)胞,成熟脂肪細(xì)胞,骨細(xì)胞,成骨細(xì)胞,成脂分化,成骨分化,課題前期工作,1、檢測(cè)Seipin基因敲除鼠的基因型，純合子和野生型分組。2、Micro CT掃描Seipin基因敲除鼠脛骨近端干骺端，記錄整理骨密度、骨小梁寬度。,數(shù)據(jù),數(shù)據(jù),研究目的及意義,目的：了解Seipin基因敲除后，小鼠骨量的變化。探究Seipin 基因與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及成脂肪分化的關(guān)系。,意義：對(duì)于seipin的研究有助于更好地認(rèn)識(shí)脂肪新生、脂滴的 動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)以及脂肪代謝與骨代謝之間的關(guān)系，也將為脂 肪營(yíng)養(yǎng)不良和肥胖等代謝性疾病的治療提供新的思路。,研究對(duì)象及內(nèi)容,研究對(duì)象：Seipin基因敲除鼠脛骨近端干骺端及長(zhǎng)骨骨髓。研究?jī)?nèi)容：1.小鼠脛骨近端干骺端骨密度、骨小梁寬度。 2.小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨、成脂肪分 化，檢測(cè)并對(duì)比純合子、野生型分化情況。,實(shí)驗(yàn)方法,1.Seipin基因敲除鼠，采用組織消化法，行DNA PCR擴(kuò)增， 并采用凝膠電泳鑒定小鼠基因型。隨機(jī)選取純合子10只 和野生型10只。30天體重約7g-15g。2.分別在小鼠30天、60天、90天行活體Micro CT掃描，分 析并記錄各時(shí)間點(diǎn)脛骨近端干骺端骨密度和骨小梁寬度。,實(shí)驗(yàn)方法,3.取小鼠長(zhǎng)骨骨髓，分離提純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用流式 細(xì)胞術(shù)對(duì)表面抗原Sca-1、CD29、CD11b、CD45進(jìn)行鑒定。 4.分別誘導(dǎo)其成骨分化和成脂肪分化，堿性磷酸酶染色、 茜素紅染色、油紅O染色觀察并記錄分化情況。,Seipin基因敲除鼠,基因型鑒定，分組,Micro CT掃描不同時(shí)間點(diǎn)（30天、60天、90天）活體小鼠骨密度和骨小梁寬度,取小鼠骨髓，分離提純骨髓干細(xì)胞,骨髓干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化，觀察并記錄分化情況,Seipin基因與干細(xì)胞成脂、成骨分化的關(guān)系,骨髓干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化，觀察并記錄分化情況,流式檢測(cè)免疫表型,技術(shù)路線圖,取小鼠骨髓，全骨髓貼壁培養(yǎng)及消化控制法，分離提純骨髓干細(xì)胞,骨髓干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化，油紅O染色，觀察并記錄分化情況,Seipin基因與干細(xì)胞成脂、成骨分化的關(guān)系,骨髓干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化，堿性磷酸酶染色、茜素紅染色，觀察并記錄分化情況,流式檢測(cè)免疫表型Sca-1、CD29、CD11b、CD45,技術(shù)路線圖,實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作,1.查閱相關(guān)文獻(xiàn)，撰寫了綜述。2.了解PCR，Micro CT，干細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化， 流式細(xì)胞檢測(cè)等技術(shù)。,主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn),首次進(jìn)行Seipin基因敲除鼠Micro CT掃描，檢測(cè)Seipin基因敲除后，小鼠骨量的變化。探討Seipin基因與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及成脂肪分化的關(guān)系