CN102894467A利用固定化酶制劑結合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法

CN102894467A利用固定化酶制劑結合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法 (10)申請公布號102894467A (43)申請公布日xx.01.30102894467A*102894467A* (21)申請?zhí)杧x10399941.8 (22)申請日xx.10.19A24B15/20(xx.01) (71)申請人云南瑞升煙草技術（集團）有限公司地址650106云南省昆明市高新開發(fā)區(qū)海源北路1699號 (72)發(fā)明人畢薇李仙劉煜宇劉麗芬 (74)專利代理機構昆明大百科專利事務所53106代理人李云 (54)發(fā)明名稱利用固定化酶制劑結合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法 (57)摘要利用固定化酶制劑結合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，是用固定化酶制劑處理煙草提取物原料獲得處理產物，再用醋酸菌發(fā)酵處理產物獲得發(fā)酵產物，然后將發(fā)酵產物濃縮處理，即得煙草提取物。 本發(fā)明可以快速有效地降低煙草提取物中淀粉、蛋白質、纖維素、木質素及果膠質的含量并適度提高煙草提取物的酸度，有效提高卷煙的香味和抽吸舒適感，提升煙草提取物的使用范圍。 (51)Int.Cl.權利要求書1頁說明書4頁 (19)中華人民共和國國家知識產權局 (12)發(fā)明專利申請權利要求書1頁說明書4頁1/1頁21.利用固定化酶制劑結合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，其特征在于，方法如下固定化酶制劑處理煙草提取物原料用淀粉酶、蛋白酶、木質素酶、果膠酶、漆酶、酯酶中的一種或多種制成酶液待用；將載體用磷酸鹽緩沖液浸泡0.5-6h后取出，作為酶制劑的固定化載體，再將此載體放入酶液中，20-45浸泡0.5-6h后將載體從酶液中取出即得到固定化酶；將煙草提取物原料加入2-5倍水滅菌后與固定化酶混勻，所加入的固定化酶與煙草提取物原料的質量比控制在0.05-10%，混勻后在20-45渥堆處理24-120h獲得處理產物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產物加入5-20倍水后接入醋酸菌種子液，接入的醋酸菌種子液與處理產物的質量比控制在0.5-10%，25-38培養(yǎng)24-120h獲得發(fā)酵產物；濃縮將發(fā)酵產物濃縮處理，即得煙草提取物。 2.根據(jù)權利要求1所述的利用固定化酶制劑結合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，其特征在于，制備酶液是采用淀粉酶、蛋白酶、木質素酶、果膠酶、漆酶、酯酶中的一種或多種與水混合配制。 3.根據(jù)權利要求2所述的利用固定化酶制劑結合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，其特征在于，配制酶液時按質量比加入穩(wěn)定劑0.2-10%和/或防腐劑0.01-2%，余量為水。 4.根據(jù)權利要求1所述的利用固定化酶制劑結合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，其特征在于，所述煙草提取物原料是指煙葉、煙葉碎片、煙末、碎煙梗中的一種或幾種。 5.根據(jù)權利要求1或2或3或4所述的利用固定化酶制劑結合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，其特征在于，用于制備固定化酶制劑的載體是表面具有微小孔隙的紙樣載體，所述紙樣載體為空氣玻纖濾材、醋酸纖維、濾紙、宣紙、石棉紙中的任意一種，孔隙直徑在1-500m，將載體剪成直徑在0.3-3cm的圓形紙片。 權利要求書102894467A21/4頁3利用固定化酶制劑結合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法技術領域0001本發(fā)明涉及煙用香料制備方法技術領域。 背景技術0002在煙草制品中，特別注重煙草香氣和吸味，常以添加一些煙草提取物作為提升抽吸品質、完善產品風格特征的手段。 然而，由于煙草提取物的原料通常是一些低次煙葉或煙草廢棄物，從而導致提取物在卷煙應用方面存在青雜氣濃重、刺激性較高、煙草本香不突出等問題，制約了煙草提取物在卷煙制品中的運用。 0003淀粉、蛋白質、纖維素、木質素及果膠質是一些會帶來不良抽吸效果的大分子物質。 目前，國內外降低卷煙原料中這些物質的方法主要通過在煙葉發(fā)酵陳化階段施加微生物和酶制劑等，所需時間較長，效果較為單一。 對于煙草提取物來說，酸性物質的存在能在一定程度上提高其抽吸口感，增加與煙絲的匹配度，調節(jié)卷煙的協(xié)調性，使整體韻調和諧。 然而，目前還沒有一種較好的方法能在快速降低淀粉、蛋白質、纖維素、木質素、果膠質等的同時還可適度增加煙草提取物的酸度。 0004酶的固定化技術是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內，酶仍能進行其特有的催化反應、并可回收及重復使用的一類技術。 利用酶的固定化技術進行酶解，相比較常規(guī)酶解，酶活力損失較少，能顯著提高酶的穩(wěn)定性和酶解效率。 關于酶的固定化技術，專利xx10026535.1提出了一種采用醋酸纖維固定化復合酶技術對富營養(yǎng)化水污染治理的專用固定化復合酶配方；專利xx10041643.X提出了一種采用固定化酶生產毛蕊花糖苷的方法；馬寧等（馬寧,謝文磊.磁性高分子微球固定化酶的制備及應用方法J.現(xiàn)代化工.xx,6:364-366.）提出了磁性高分子微球固定化酶的制備及應用方法；這些專利或文章都沒有涉及到利用固定化酶制備煙草提取物，且所述的固定化酶制劑的制備較為復雜，與煙草提取物的兼容性較差。 0005醋酸菌是一類能使糖類和酒精氧化成醋酸等產物的細菌。 工業(yè)上可以利用醋酸菌釀醋、制做醋酸和葡萄糖酸等，也可利用醋酸菌進行發(fā)酵產酸，通過調節(jié)醋酸菌的培養(yǎng)條件和發(fā)酵底物，獲得適宜的發(fā)酵產品。 關于醋酸菌的專利較多，但都集中在食醋、酒等釀造領域；專利xx10130665.0提出一種發(fā)酵型煙用羅漢果浸膏的制備方法，其中提到利用醋酸菌發(fā)酵羅漢果浸膏后作為煙用添加劑使用；但這些專利和文章都沒有提到在煙草提取物中直接利用醋酸菌進行發(fā)酵的工藝。 發(fā)明內容0006本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術的不足，提供一種利用紙樣載體固定化酶制劑結合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，以快速有效地降低煙草提取物中淀粉、蛋白質、纖維素、木質素及果膠質的含量并適度提高煙草提取物的酸度，有效提高卷煙的香味和抽吸舒適感，提升煙草提取物的使用范圍。 0007本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)說明書102894467A32/4頁4利用固定化酶制劑結合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，方法如下固定化酶制劑處理煙草提取物原料用淀粉酶、蛋白酶、木質素酶、果膠酶、漆酶、酯酶中的一種或多種制成酶液待用；將紙樣載體用磷酸鹽緩沖液浸泡0.5-6h后取出，作為酶制劑的固定化載體，再將此載體放入酶液中，20-45浸泡0.5-6h后將載體從酶液中取出即得到固定化酶；將煙草提取物原料加入2-5倍水滅菌后與固定化酶混勻，所加入的固定化酶與煙草提取物原料的質量比控制在0.05-10%，混勻后在20-45渥堆處理24-120h獲得處理產物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產物加入5-20倍水后接入醋酸菌種子液，接入的醋酸菌種子液與處理產物的質量比控制在0.5-10%，25-38培養(yǎng)24-120h獲得發(fā)酵產物；濃縮將發(fā)酵產物濃縮處理，即得煙草提取物。 0008本發(fā)明制備酶液是采用淀粉酶、蛋白酶、木質素酶、果膠酶、漆酶、酯酶中的一種或多種與水混合配制。 配制酶液時可按質量比加入穩(wěn)定劑0.2-10%和/或防腐劑0.01-2%，余量為水。 所述煙草提取物原料是指煙葉、煙葉碎片、煙末、碎煙梗中的一種或幾種。 本發(fā)明用于制備固定化酶制劑的載體是表面具有微小孔隙的紙樣載體，所述紙樣載體為空氣玻纖濾材、醋酸纖維、濾紙、宣紙、石棉紙中的任意一種，孔隙直徑在1-500m，將載體剪成直徑在0.3-3cm的圓形紙片。 本發(fā)明所述固定化酶制劑制備后綜合酶活為2-80U/cm2，這樣的酶活力，能夠保持渥堆狀態(tài)下處理煙草提取物原料中淀粉、蛋白質、木質素和果膠質的能力，且渥堆處理的方式為酶發(fā)揮最佳處理能力創(chuàng)造了極佳的少氧環(huán)境并保持了適宜的溫度，更相似于煙葉自然陳化發(fā)酵的條件，但與之相比大大縮短了時間。 0009本發(fā)明所述用于發(fā)酵煙草提取物的醋酸菌屬于常見的釀造食醋的醋酸桿菌，其產酸能力較強，能夠在較短時間內利用煙草原料產生一定量的醋酸，所產生的醋酸創(chuàng)造了微弱的酸性環(huán)境，為煙草提取物提升了香氣質、提高了香氣量，擴大了運用范圍。 0010利用紙樣載體將酶進行固定化后制成固定化酶制劑，用于快速酶解煙草提取物原料中的淀粉、蛋白質、纖維素、木質素及果膠質等大分子物質，之后結合醋酸菌發(fā)酵產酸，能在較短時間內既降低原料中一些會帶來不良抽吸效果的大分子物質含量，又產生了能提高抽吸舒適度的酸性物質。 具體實施方式0011為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下通過實施例及試驗數(shù)據(jù)，對本發(fā)明做進一步詳細說明。 所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。 0012利用固定化酶制劑結合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，方法如下固定化酶制劑處理煙草提取物原料用淀粉酶、蛋白酶、木質素酶、果膠酶、漆酶、酯酶中的一種或多種制成酶液待用；將紙樣載體用磷酸鹽緩沖液浸泡0.5-6h后取出，作為酶制劑的固定化載體，再將此載體放入酶液中，20-45浸泡0.5-6h后將載體從酶液中取出即得到固定化酶；將煙草提取物原料加入2-5倍水滅菌后與固定化酶混勻，所加入的固定化酶與加水滅菌后的煙草提取物原料的質量比控制在0.05-10%，混勻后在20-45渥堆處說明書102894467A43/4頁5理24-120h獲得處理產物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產物加入5-20倍水后接入醋酸菌種子液，接入的醋酸菌種子液與處理產物的質量比控制在0.5-10%，25-38培養(yǎng)24-120h獲得發(fā)酵產物；濃縮將發(fā)酵產物濃縮處理，即得煙草提取物。 0013實施例1固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質量比用25%淀粉酶、0.2%酶穩(wěn)定劑、0.01%防腐劑和余量的水制成酶液；將空氣玻纖濾材剪成3cm的圓形紙片放入pH7.5磷酸鹽緩沖液中浸泡0.5h后取出，再放入酶液中20浸泡6h制成固定化酶制劑；將200g津巴布韋煙葉碎片加入5倍水滅菌后接入1g固定化酶制劑，混勻后35渥堆處理60h獲得處理產物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產物加入20倍水后接入醋酸菌種子液，醋酸菌種子液與處理產物的質量比為10%，25培養(yǎng)120h獲得發(fā)酵產物；濃縮發(fā)酵產物至密度為1.3即得煙草提取物。 0014實施例2固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質量比用將30%蛋白酶、5%酶穩(wěn)定劑和余量的水制成酶液；將濾紙剪成0.3cm的圓形紙片放入pH7.0磷酸鹽緩沖液中浸泡6h后取出，再放入酶液中35浸泡0.5h制成固定化酶制劑；將200g土耳其香料煙煙末加入2倍水滅菌后接入0.1g固定化酶制劑，混勻后45渥堆處理120h獲得處理產物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產物加入10倍水后接入醋酸菌種子液，醋酸菌種子液與處理產物的質量比為0.5%，38培養(yǎng)24h獲得發(fā)酵產物；濃縮發(fā)酵產物至密度為1.5即得煙草提取物。 0015實施例3固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質量比用10%木質素酶、2%防腐劑和余量的水制成酶液；將石棉紙剪成1.5cm的圓形紙片放入pH6.5磷酸鹽緩沖液中浸泡3h后取出，再放入酶液中30浸泡4h制成固定化酶制劑；將200g巴西粉碎煙梗加入3倍水滅菌后接入6.5g固定化酶制劑，混勻后37渥堆處理24h獲得處理產物。 0016醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產物加入5倍水后接入醋酸菌種子液，醋酸菌種子液與處理產物的質量比為5%，30培養(yǎng)60h獲得發(fā)酵產物；濃縮發(fā)酵產物至密度為1.2即得煙草提取物。 0017實施例4固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質量比用15%果膠酶、1.0%酶穩(wěn)定劑、1.0%防腐劑和余量的水制成酶液；將宣紙剪成0.5cm的圓形紙片放入pH6.5磷酸鹽緩沖液中浸泡2h后取出，再放入酶液中40浸泡5h制成固定化酶制劑；將200g紅花大金元煙葉碎片加入4倍水滅菌后接入2.5g固定化酶制劑，混勻后45渥堆處理24h獲得處理產物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將處理產物加入5倍水后接入醋酸菌種子液，醋酸菌種子液與處理產物的質量比為5%，35培養(yǎng)40h獲得發(fā)酵產物；濃縮發(fā)酵產物至密度為1.3即得煙草提取物。 0018實施例5說明書102894467A54/4頁6固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質量比用5%漆酶和余量的水制成酶液；將醋酸纖維剪成1.0cm的圓形紙片放入pH6.5磷酸鹽緩沖液中浸泡1.5h后取出，再放入酶液中45浸泡1.5h制成固定化酶制劑；將200g K326煙末加入3倍水滅菌后接入20g固定化酶制劑，混勻后20渥堆處理24h獲得處理產物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產物加入3.5倍水后接入醋酸菌種子液，醋酸菌種子液與處理產物的質量比為3%，25培養(yǎng)80h獲得發(fā)酵產物即發(fā)酵液；濃縮發(fā)酵液至密度為1.1即得煙草提取物。 0019實施例6固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質量比用3%酯酶和余量的水制成酶液；將石棉紙剪成2.0cm的圓形紙片放入pH6.5磷酸鹽緩沖液中浸泡5h后取出，再放入酶液中30浸泡0.5h制成固定化酶制劑；將200g云煙87粉碎煙梗加入2倍水滅菌后接入5g固定化酶制劑，混勻后37渥堆處理36h獲得處理產物。 0020醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產物加入10倍水后接入醋酸菌種子液，醋酸菌種子液與處理產物的質量比為3.5%，36培養(yǎng)30h獲得發(fā)酵液；濃縮發(fā)酵液至密度為1.2即得煙草提取物。 0021實施例7固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質量比用10%淀粉