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洋蔥多糖提取及其抗氧化性研究目 錄摘要3Abstract3前言:41. 材料與方法41.1 材料41.1.1 原料與試劑:41.1.2 主要儀器設(shè)備:41.2 方法41.2.1 洋蔥多糖的提取41.2.2 洋蔥多糖的提取條件研究51.2.3 洋蔥多糖含量的測定61.3 抗氧化活性測定71.3.1 抗氧化活性測定原理:71.3.2 抗氧化活性測定流程:82. 結(jié)果與分析82.1 單因素選擇試驗結(jié)果分析82.1.1 提取時間實驗結(jié)果分析(結(jié)果見表6,圖2)82.1.2 提取溫度選擇試驗結(jié)果與分析(結(jié)果見表7,圖3)92.1.3 料水比選擇結(jié)果及分析(結(jié)果見表8,圖4)92.2 正交試驗結(jié)果與分析(結(jié)果見表9)102.3 測定方法穩(wěn)定性試驗112.4 測定方法重現(xiàn)性試驗112.5 測定方法的回收率試驗(試驗結(jié)果見表12)112.6 總抗氧化能力測定結(jié)果113. 結(jié)論123.1123.2123.312參考文獻(xiàn)13致 謝14洋蔥多糖提取及其抗氧化性研究生物科學(xué)與工程學(xué)院【摘要】 本實驗對洋蔥多糖水浸醇提工藝的最佳條件以及洋蔥抗氧化活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,提取洋蔥多糖的最佳工藝條件為:提取時間3.5h,提取溫度70,料液比1:25。洋蔥多糖具有較強的還原能力,且在一定范圍內(nèi)抗氧化活性呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。本實驗的方法是用水提純沉法提取洋蔥多糖,用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量,用分光光度計在490nm波長處測定吸光值。制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,其相關(guān)系數(shù)r=0.9954,回歸方程線性關(guān)系良好。用抗氧化性試劑盒對不同濃度下洋蔥多糖溶液的總抗氧化活性進(jìn)行測定,效果顯著。本實驗整套方法簡單易行、穩(wěn)定、快速?!娟P(guān)鍵詞】洋蔥;多糖;提取工藝;抗氧化活性。Study on the Extraction and Antioxidant Activity of Onion PolysaccharideBiological Science and Engineering College Tangmin Major:Biological Technology Student Number: 20083578Advisor:Pang Huizhong(Senior Experimentalist)Abstract The optimum extraction process and antioxidant activity of onion polysaccharide was investigated in this paper.The result showed that the optimum extraction condition was extracting time 3.5h, extracting temperature 70,and the solid to liquid ratio of 1:25.The onion polysaccharide had strong reducing power ,and its antioxidant activity was liner with its concertration to a certain extent.The method of this experiment was extracting onion polysaccharide through hot water extraction and alcohol precipitation.The content of polysaccharide was determined with phenol-sulfuric colorimetry method by measuring the absorbance under 490nm light wave in the spectrophotometry.The standard curve of glucose was manufactured with a correlation coefficient r=0.9954,and the regression equation had a good linear relation.Using antioxidant activity kit to determine total antioxidation under different concertration of polysaccharide had also gained a significant effect.The set of method of this experiment was simple,stable and fast.Keywords onion; polysaccharide; Extraction conditions; antioxidation 前言:洋蔥(Allium cep a L)為百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)植物,近代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),洋蔥含有硫化物、類黃酮、笨丙素酚類、甾體皂苷類、含氯化合物、前列腺素類和多糖等多種化學(xué)成分,具有消炎抑菌、防癌抗癌、利尿止瀉及降血糖、降血脂、降膽固醇、降血壓、抗血小板凝聚、預(yù)防心腦血管病、抗氧化、美容等多種藥理作用1。目前,對洋蔥中活性成分的研究還主要集中在含硫化合物上,對洋蔥多糖的研究很少,國內(nèi)在此方面的研究更少。多糖是一類廣泛存在于動植物、微生物細(xì)胞中重要的生物大分子物質(zhì)。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展,人們逐漸發(fā)現(xiàn)不同來源的多糖具有廣泛而復(fù)雜的生物學(xué)活性,已引起醫(yī)藥界的高度重視,并成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點之一。本實驗以熱水浸提、乙醇沉淀的方法從洋蔥中提取多糖,并對洋蔥多糖抗氧化作用進(jìn)行初步研究,為進(jìn)一步開發(fā)洋蔥的保健作用提供理論依據(jù)。1. 材料與方法1.1 材料1.1.1 原料與試劑:新鮮洋蔥(購自農(nóng)大南區(qū)食堂)、無水乙醇(AR)、苯酚(AR)、葡萄糖(AR)、濃硫酸(AR)、正丁醇(AR)、三氯甲烷(AR)總抗氧化能力測定試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)。1.1.2 主要儀器設(shè)備:植物粉碎機、722型光柵分光光度計(上海精密儀器廠)、電熱恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)、德國sartorius型電子天平(精密度為萬分之一)、1012型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠)、冰箱、TDL4型電動離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。1.2 方法1.2.1 洋蔥多糖的提取洋蔥多糖提取的流程為:洋蔥切塊烘干粉碎稱樣根據(jù)料水比加水定容水浴鍋加熱浸提取出4000r、15min離心取上清液取一定量加無水乙醇在冰箱內(nèi)于5下放置24h取出4000r、15min離心取其沉淀物脫蛋白粗多糖。具體如下:(1)、烘干粉碎:將買的新鮮洋蔥去除外皮切成小塊,盛于托盤放入干燥箱,在80下烘4h,用粉碎機粉碎,過60目篩,放入干燥容器內(nèi)。(2)、配制洋蔥懸濁液:分別取12(正交試驗中9支)支試管(每只試管標(biāo)好號),精確秤取各1.0000g洋蔥粉,根據(jù)試驗設(shè)計的各種條件配制各個試管懸濁液。(3)、水溶浸提:將配制好的洋蔥懸濁液搖勻后放入恒溫水浴鍋中,按各自的浸提條件進(jìn)行水浴浸提,按時取出各試管,冷卻至室溫,并充分搖勻。(4)、離心:將浸提好的各試管中的洋蔥懸濁液于4000r的離心機中離心20min,將各離心管中的溶液倒入已清洗的原試管中。(5)、醇沉:在單因素試驗中,除試管、以外的十只試管,從離心所得的上清液中取1/5的量放入離心管中,試管、的則取1/10的量放入離心管中;在正交試驗中,各取1/10的量,放入離心管中。再在各離心管中分別加入兩倍于上清液的無水乙醇,充分搖勻,放入5的冰箱中醇沉24h。(6)、再次離心:按時從冰箱中取出后于4000r再次離心20min,去掉上清液,取其沉淀物。(7)、脫蛋白:在離心管內(nèi)加入少量水?dāng)嚢枞芙獬恋聿⒍ㄈ葜?ml,在粗多糖溶液中加入該溶液體積的0.2倍氯仿(即0.4ml)和0.05倍正丁醇(即0.1ml)反應(yīng)30min,經(jīng)離心去除沉淀即得洋蔥多糖溶液。1.2.2 洋蔥多糖的提取條件研究1.2.2.1 單因素試驗已有的研究結(jié)果表明2,影響多糖提取得率的主要因素有:溫度、時間、料液比。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,選擇浸提時間、溫度、料液比3項為考察因素,固定其中兩個因素,變化另一個因素,試驗見表1。表1 單因素試驗方案試驗號提取時間(h)提取溫度()料水比11.5801:202.53.54.522.5601:2070809032.5801:101:151:201:251.2.2.2 正交試驗根據(jù)單因素試驗確定的條件,進(jìn)行正交試驗,以得出最佳提取條件。采用L9(34)正交試驗,方案見表2,表3。 表2 正交試驗因素水平表L9(34)因 素 水平提取溫度() A提取時間(h) B 料水比 C1602.51:152703.51:203804.51:25表 3 正交試驗安排表L9(34)試驗號溫度() A提取時間(h) B料水比 C160(1)2.5(1)1:15(1)260(1)3.5(2)1:20(2)360(1)4.5(3)1:25(3)470(2)2.5(1)1:25(3)570(2)3.5(2)1:15(1)670(2)4.5(3)1:20(2)780(3)2.5(1)1:20(2)880(3)3.5(2)1:25(3)980(3)4.5(3)1:15(1)1.2.3 洋蔥多糖含量的測定1.2.3.1 測定方法:苯酚硫酸比色法原理乙醇沉淀提取多糖以除去單糖、雙糖,氨基酸及醇溶蛋白質(zhì)等干擾成分,然后用水在一定溫度下提取可溶性多糖和蛋白質(zhì),最終得到多糖、蛋白質(zhì)的水溶液。然后用丁醇、氯仿脫蛋白,即可得到一定量的粗多糖水溶液,然后進(jìn)行定量測定。多糖在濃硫酸作用下水解成單糖,并迅速脫水生成糠醛衍生物,與苯酚結(jié)合生成有色化合物,在490nm波長下,用分光光度計測定其吸光度。1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制1.2.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:(1)、0.1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱取在105恒溫箱中干燥至恒重的葡萄糖0.5000g,加水定容至100ml精確移取1ml至50ml容量瓶定容即得0.1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。(2)、6%苯酚溶液:稱取6.000g苯酚于100ml容量瓶中定容至刻度即得6%苯酚溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。(3)、濃硫酸:直接使用分析純的濃硫酸。1.2.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:(結(jié)果見表4,圖1)準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml分別置于各試管中,各加水定容至2.0ml,再各加6%苯酚溶液1.0ml,搖勻;再在冰水中邊震蕩邊緩慢滴加濃硫酸5ml,搖勻后冷卻至室溫再放入沸水浴中加熱15min,再取出放入冰水中冷卻至室溫。以加0.0ml葡萄糖溶液的試管作為空白對照,于490nm處測吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸曲線方程: y = 0.006x + 0.0182,R2= 0.9954 表4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗結(jié)果葡萄糖含量(ug)20406080100120A490nm/0.2670.3760.4850.6400.739圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線1.2.3.3 樣品中洋蔥多糖含量的測定1.2.3.3.1 待測樣品溶液的配制:在單因素實驗中,將除試管、以外的十只試管所得的各樣品加蒸餾水稀釋10倍,試管、的樣品加蒸餾水稀釋5倍。在正交試驗中,將9支試管所得樣品加蒸餾水稀釋5倍。以保證待測樣品中多糖濃度處于合理區(qū)間。1.2.3.3.2 樣品中雪蓮果多糖含量的測定:精密移取稀釋后的各樣品液2.0ml,按照作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法即再各加6%苯酚溶液1.0ml,搖勻,緩慢滴加濃硫酸5.0ml,搖勻后冷卻至室溫再放入沸水浴中加熱15min,取出放入冰水中冷卻至室溫。同時取蒸餾水2.0ml加6%苯酚溶液1.0ml,搖勻,緩慢滴加濃硫酸5.0ml,搖勻后冷卻至室溫再放入沸水浴中加熱15min,取出放入冰水中冷卻至室溫,作為空白對照。于490nm處測吸光度來測定樣品溶液的吸光度,再根據(jù)回歸方程計算樣品中洋蔥多糖的含量。(用提取的洋蔥多糖提取率表示)1.2.3.3.3 樣品中多糖含量的計算:根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程:y= 0.006x + 0.0812,R2= 0.9954,把所有的吸光值代入上述方程,計算出樣品的多糖濃度x,然后再換算成一定質(zhì)量洋蔥多糖提取率W。 提取多糖的量 (查曲線得多糖含量/2)V多糖提取率= 100%= 100% 香蕉皮樣品的質(zhì)量 香蕉皮樣品的質(zhì)量V從1.000g洋蔥粉末熱水浸提液到待測樣品溶液所稀釋的的體積總倍數(shù)1.3 抗氧化活性測定1.3.1 抗氧化活性測定原理:機體中有許多抗氧化性物質(zhì),能使3價Fe還原成2價Fe,2價Fe可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物,通過比色可測出其抗氧化能力的高低。1.3.2 抗氧化活性測定流程:(1)、洋蔥多糖溶液的制?。焊鶕?jù)正交試驗結(jié)果確定的最佳浸提條件,并根據(jù)最佳浸提條件精確稱取3.0000g雪蓮果粉,按1.2.1的操作流程操作,得到較高濃度洋蔥多糖母液。(2)、將獲得的多糖母液通過加一定量的蒸餾水稀釋,用苯酚-硫酸法測定稀釋后的多糖含量,直至測得的OD值處于0.2-0.7區(qū)間及其附近,以保證待測抗氧化活性多糖溶液具有較合理的濃度。按照1.2.3.3.2進(jìn)行,得到初始洋蔥多糖溶液OD值為0.758,按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線查出多糖濃度為61.65ug/ml。(3)、總抗氧化能力測定試劑的配制:將試劑二的粉劑倒入錐形瓶,加120ml蒸餾水充分溶解,在37水浴鍋中加速溶解;試劑三在使用前取貯備液用稀釋液以1:19稀釋,現(xiàn)用現(xiàn)配。(4)、操作步驟:取12根試管,分成六組,一支實驗組(標(biāo)號為+),一支對照組(標(biāo)號為-)。把這十二支試管標(biāo)號為1+、1-,2+、2-,3+、3-,按表5進(jìn)行,表中A分別代表0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml多糖樣本溶液。表5操作步驟表試劑加樣管測定管(ml)對照管(ml)試劑一11待測樣本A試劑二22試劑三應(yīng)用液0.50.5充分混勻,37水浴30min試劑四0.10.1待測樣本A(5)、測定吸光度:將配制好的溶液混勻放置10min,用蒸餾水作為參比溶液在520nm波長處調(diào)零1cm光徑,并測定各溶液的吸光度。(6)、計算香蕉皮多糖溶液總抗氧化能力:總抗氧化能力定義:在37時,每分鐘每毫升多糖溶液使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加0.01時,為一個總抗氧化能力單位。公式:總抗氧化能力(單位/毫升多糖溶液)= (OD1OD2)30nN 0.01 OD1測定管吸光度值OD2對照管吸光度值N反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)(反應(yīng)液總體積/取樣量)n樣本測試前稀釋倍數(shù)2. 結(jié)果與分析2.1 單因素選擇試驗結(jié)果分析2.1.1 提取時間實驗結(jié)果分析(結(jié)果見表6,圖2)表6 提取時間實驗結(jié)果時間(h)2345OD值0.1720.2360.4240.396 圖2浸提時間選擇由圖可知,提取時間在4h時,多糖提取量最大,繼續(xù)延長水浴時間多糖提取量反而減小。因此,提取時間選擇4h較合理。2.1.2 提取溫度選擇試驗結(jié)果與分析(結(jié)果見表7,圖3)表 7提取溫度選擇試驗結(jié)果溫度()60708090OD值0.2130.3260.4630.409圖3 提取溫度選擇由圖可知,提取溫度在6080之間多糖的提取量逐漸增大,至80是急劇減小,因此,采用80提取溫度較合理。2.1.3 料水比選擇結(jié)果及分析(結(jié)果見表8,圖4)表8 料水比選擇結(jié)果料水比1:151:201:251:30OD值0.3320.4070.4620.358圖 4料水比的選擇由圖可知,料水比在1:15時多糖提取量較低,至1:25時多糖提取量達(dá)到峰值,增加加水量多糖提取量逐漸減少。因此,采用料水比為1:25時較合理。2.2 正交試驗結(jié)果與分析(結(jié)果見表9)表9正交試驗設(shè)計及極差分析結(jié)果試驗號 溫度() A提取時間(h) B料水比 C多糖提取率W (%)170(1)3(1)1:20(1)1.490270(1)4(2)1:25(2)1.313370(1)5(3)1:30(3)2.011480(2)4(1)1:30(3)2.278580(2)5(2)1:20(1)1.742680(2)3(3)1:25(2)1.641790(3)5(1)1:25(2)1.579890(3)3(2)1:30(3)1.432990(3)4(3)1:20(1)1.258K14.8145.3474.490K25.6614.4874.533K34.6294.9105.271R1.0320.8600.781ABC根據(jù)以上試驗結(jié)果,直觀分析表明:三個因素對多糖提取率的影響大小依次是ABC,即溫度對多糖提取率的影響最大,其次是浸提時間,影響最小的是料液比。最佳提取條件是A2B1C3,即使用80,浸提4h,料水比1:30條件下提取。2.3 測定方法穩(wěn)定性試驗精確稱取0.5000g的雪蓮果粉,經(jīng)1.2.1和1.2.3.3.1的方法制取待測樣品溶液,按1.2.3.3.2方法測定吸光度,每隔30min測定其穩(wěn)定性。穩(wěn)定性測定結(jié)果見表10。表 10 穩(wěn)定性試驗時間(h)0.51.01.52.0平均含量RSDOD值0.3000.3430.3550.3510.3370.090由上表可知,每隔30min測定一次吸光度,連續(xù)2h考察其穩(wěn)定性,結(jié)果RSD為0.090,表明在2h內(nèi)穩(wěn)定。2.4 測定方法重現(xiàn)性試驗精確稱取四份都是0.5000g的同一批原料雪蓮果粉樣品,經(jīng)1.2.1和1.2.3.3.1的方法同時制取四份待測樣品溶液,按1.2.3.3.2方法測定吸光度,計算雪蓮果多糖的含量,檢驗測定方法的重現(xiàn)性,結(jié)果見表11。表11 重現(xiàn)性試驗樣品編號1234平均含量RSDOD值0.3510.3450.3790.3730.3620.046四份相同材料制成的多糖樣品溶液其RSD為0.046,可知其試驗結(jié)果效果較好。2.5 測定方法的回收率試驗(試驗結(jié)果見表12)表12 回收率試驗編號 香蕉皮多糖含量(ug)加入葡萄糖的量(ug)實測值(ug)回收率(%)X (%)RSD(%)178.1640117.2397.67278.1650126.7997.26378.1660136.4597.1597.550.46478.1670146.3597.41578.1680156.7898.27本試驗所使用測定方法的平均回收率為97.55%,RSD=0.46%(n=5),說明該方法測定雪蓮果多糖含量具有較高的準(zhǔn)確度。2.6 總抗氧化能力測定結(jié)果通過1.3.2步驟得到數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果如表13,圖5。表13在抗氧化能力測定結(jié)果編號123456OD10.0410.0480.0530.0590.0640.067OD20.1090.1850.2580.3300.4010.465總抗氧化能力8.3878.6778.9059.0339.2719.287 圖5 在抗氧化能力測定結(jié)果由表13和圖5可知,香蕉皮多糖還原力較強,且還原能力隨著多糖濃度的增加而增大,提示香蕉皮多糖的抗氧化能力隨著多糖濃度的增加而增強,且濃度達(dá)到一定程度時總抗氧化能力值增加不大。3. 結(jié)論3.1本實驗對香蕉皮多糖的提取工藝進(jìn)行研究,探討浸提時間、料水比及溫度對多糖得率的影響,并對香蕉皮多糖的抗氧化活性進(jìn)行了研究。在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過正交試驗確定最佳提取工藝條件。結(jié)果表明:料水比對多糖提取率的影響最大,其次是浸提溫度,影響最小的是浸提時間。香蕉皮多糖的最佳提取條件為水浴條件70,浸提時間3h,料水比為1:20條件下提取,香蕉皮多糖提取率為1.6416%。3.2通過對穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和回收率試驗來考察方法的科學(xué)性和穩(wěn)定性。經(jīng)過分析,本方法穩(wěn)定性RSD為0.75%、重現(xiàn)性RSD為1.41%、平均回收率為99.94%、RSD為0.56%(n=5)。說明采取苯酚硫酸法對香蕉皮多糖進(jìn)行測定較穩(wěn)定、準(zhǔn)確性好。但因其成分多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,進(jìn)一步的分離和純化還待研究。3.3 香蕉皮多糖具有的抗氧化活性使其有望作為天然抗氧化劑和功能性食品而得到開發(fā)應(yīng)用,具有較高的研究開發(fā)價值。對于香蕉皮多糖的其他方面如分離純化、組份鑒定、分子量測定和其他生物活性測定等還有待于今后進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1馮長根,吳悟賢,劉霞等 洋蔥的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展 J. 上海中醫(yī)藥雜志, 2003,37(7):64-652丘玉昌,吳曙光,徐偉.米糠多糖的提取及其免疫調(diào)節(jié)作用J.中國生化藥物雜志,1999,20(2):91-933何忠孝主編生物化學(xué)實驗技術(shù)M 化學(xué)工業(yè)出版社4李如亮生物化學(xué)實驗 M武漢大學(xué)出版社19985郭豫梅野生石參中多糖含量的測定及其抗氧化活性的研究D 2011.66孫文凱,袁懷波,許衛(wèi),戚良號 芡實殼提取物抗氧化能力研究J 食品工藝科技 2011.77張赟彬,龔鋼明,戴妙妙 甘薯多酚粗提取液的抗氧化活性研究J中國糧油學(xué)報,2007,22( 5) :76798陳衛(wèi)軍,曹煒 麥胚提取物的抗氧化性研究J 食品科學(xué),2004,25( 10) :2943009牛付閣,王紀(jì)平,王芳,戴成國,段玉峰 覆盆子糖蛋白粗提物體內(nèi)抗氧化作用研究 J食品工業(yè)科技2010.1210董 蘭,鄭申聲,陳昌國 蓮心總堿的提取分離及其抗氧化性研究 J 2011.711呂明生,王淑軍,徐興權(quán),盤賽坤,劉 姝,張兆兵 雪蓮薯多糖浸提工藝及其對羥自由基清除作用研究 J 食品工業(yè)科技 2010.212張強,牟雪姣,周正義,等 洋蔥多糖的提取及其抗氧化活性研究J食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33( 1) :13814113吳曉鵬,王一飛,劉秋英,等 苦丁茶多糖抗氧化活性研究J食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34( 2) :3436致謝本實驗在生物科學(xué)與工程學(xué)院實驗室中完成,在此對幫助過我的系領(lǐng)導(dǎo)、老師說一聲:謝謝。本實驗是在龐會忠老師的指導(dǎo)下完成實驗的,從實驗設(shè)計方案的設(shè)計到實驗儀器與設(shè)備的整理,從實驗理論講解到實驗操作的具體實施乃至具體性的實踐,從論文格式的指導(dǎo)到論文具體細(xì)節(jié)的修改都得到了龐會忠老師的悉心指導(dǎo)和幫助。我被他那一絲不茍的實驗態(tài)度和精湛的操作技能所折服。在此特別感謝龐會忠老師,他讓我在整個實驗過程中學(xué)到了許多以前未曾學(xué)到的專業(yè)理論知識和實際操作技能。同時也特別感謝生物科學(xué)與工程學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)對畢業(yè)生的大力支持,提供大量經(jīng)費給我們實際操作的機會。再次表示感謝!襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇袁節(jié)膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肅芅蕿袈羋膁蚈羀肁蒀蚇蝕襖莆蚇螂肀莂蚆羅袂羋蚅蚄膈膄蚄螇羈蒂蚃衿膆莈螞羈罿芄螁蟻膄膀螁螃羇葿螀裊膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃螞肂莈蒂螄羋芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羈莀蒈羃膇芆蕆蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃蠆羆艿薃袁節(jié)膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肅芅蕿袈羋膁蚈羀肁蒀蚇蝕襖莆蚇螂肀莂蚆羅袂羋蚅蚄膈膄蚄螇羈蒂蚃衿膆莈螞羈罿芄螁蟻膄膀螁螃羇葿螀裊膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃螞肂莈蒂螄羋芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羈莀蒈羃膇芆蕆蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃蠆羆艿薃袁節(jié)膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肅芅蕿袈羋膁蚈羀肁蒀蚇蝕襖莆蚇螂肀莂蚆羅袂羋蚅蚄膈膄蚄螇羈蒂蚃衿膆莈螞羈罿芄螁蟻膄膀螁螃羇葿螀裊膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃螞肂莈蒂螄羋芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羈莀蒈羃膇芆蕆蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃蠆羆艿薃袁節(jié)膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肅芅蕿袈羋膁蚈羀肁蒀蚇蝕襖莆蚇螂肀莂蚆羅袂羋蚅蚄膈膄蚄螇羈蒂蚃衿膆莈螞羈罿芄螁蟻膄膀螁螃羇葿螀裊膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃螞肂莈蒂螄羋芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羈莀蒈羃膇芆蕆蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃蠆羆艿薃袁節(jié)膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肅芅蕿袈羋膁蚈羀肁蒀蚇蝕襖莆蚇螂肀莂蚆羅袂羋蚅蚄膈膄蚄螇羈蒂蚃衿膆莈螞羈罿芄螁蟻膄膀螁螃羇葿螀裊膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃螞肂莈蒂螄羋芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羈莀蒈羃膇芆蕆蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃蠆羆艿薃袁節(jié)膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肅芅蕿袈羋膁蚈羀肁蒀蚇蝕襖莆蚇螂肀莂蚆羅袂羋蚅蚄膈膄蚄螇羈蒂蚃衿膆莈螞羈罿芄螁蟻膄膀螁螃羇葿螀裊膃螈聿蒄葿袁羈莀蒈羃膇芆蕆蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃蠆羆艿薃袁節(jié)膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肅芅蕿袈羋膁蚈羀肁蒀蚇蝕襖莆蚇螂肀莂蚆羅袂羋蚅蚄膈膄蚄螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃螞肂莈蒂螄羋芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羈莀蒈羃膇芆蕆蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃蠆羆艿薃袁節(jié)膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肅芅蕿袈羋膁蚈羀肁蒀蚇蝕襖莆蚇螂肀莂蚆羅袂羋蚅蚄膈膄蚄螇羈蒂蚃衿膆莈螞羈罿芄螁蟻膄膀螁螃羇葿螀裊膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃螞肂莈蒂螄羋芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿節(jié)衿羈腿莄螞襖羋蕆袇螀芇蕿蝕聿芆艿蒃肅芅蒁螈羈芄薃薁袆芃芃螆螂芃蒞蕿肁節(jié)蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈螞螂羂薁袈肀肁芀蟻羆肁莃袆袂肀薅蠆袈聿蚇蒂膇肈莇螇肅肇葿薀罿肆薂螆裊肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羈膂莈蚅袇膁蒀袀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